Partie 1 : La méthode ELISA

La méthode immuno-enzymatique ELISA (de l’anglais Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) qui correspond donc à un dosage immuno-enzymatique sur support solide, est un examen courant de laboratoire.

Cette méthode est principalement utilisée en immunologie pour détecter la présence d’un anticorps ou d’un antigène dans un échantillon.

L’ELISA est une technique biochimique utilisant un ou deux anticorps. L’un de ceux-ci est spécifique de l’antigène, tandis que l’autre réagit avec les complexes antigène-anticorps et est couplé à une enzyme. Cet anticorps secondaire, responsable du nom de la technique, permet, en présence d’un substrat chromogène, l’émission d’un signal par la production d’un produit coloré détectable voir quantifiable.

Voici deux animations expliquant le principe général d’une méthode ELISA

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L’ELISA pouvant être utilisé tant pour évaluer la présence d’un antigène que celle d’un anticorps dans un échantillon, c’est un outil efficace à la fois pour déterminer des concentrations sériques d’anticorps (comme pour le test HIV), que pour détecter la présence d’un antigène. Il a également trouvé des applications dans l’industrie alimentaire, pour détecter des allergènes alimentaires.

Ce test entre dans le cadre plus général des EIA (enzyme immunoassays), dans lequel le dosage est couplé à une réaction catalysée par une enzyme qui libère un composant coloré suivi par une spectroscopie, par opposition aux RIA (radio immunoassays) dans lesquels l’anticorps est marqué par un radioélément et dont le dosage mesure un nombre de désintégrations par secondes.

Ci dessous un document présentant la diversité des méthodes utilisables.

Partie 2 : VIH et technique de dépistage

Le virus de l’immunodéficience humaine (VIH) est un rétrovirus infectant l’homme et responsable du syndrome d’immunodéficience acquise (SIDA), qui est un état affaibli du système immunitaire le rendant vulnérable à de multiples infections opportunistes.

Transmis par plusieurs fluides corporels : sang, sécrétions vaginales, sperme ou lait maternel, le sida est aujourd’hui considéré comme une pandémie ayant causé la mort de plus de 25 millions de personnes entre 1981 et aujourd’hui.

Bien qu’il existe des traitements antirétroviraux luttant contre le VIH et retardant par conséquent l’apparition du SIDA, réduisant ainsi la mortalité, il n’existe à l’heure actuelle aucun vaccin ou traitement définitif. La prévention, qui passe notamment par les rapports sexuels protégés et la connaissance de son statut sérologique de manière à éviter les infections d’autrui, est le moyen de lutte le plus efficace.

Structure du virus

Le virus du VIH apparaît en microscopie électronique comme une particule sphérique de 80 à 120 nanomètres de diamètre.

 L’enveloppe externe

Elle est composée de lipides issus des cellules humaines et de protéines virales qui traversent cette membrane lipidique :
— La protéine gp120 qui se fixe spécifiquement sur les protéines CD4 des lymphocytes et des macrophages.
— La protéine gp 41 participe à la fusion entre l’enveloppe virale et la membrane phospholipidique de la cellule.

 La capside

Elle est faite de protéines virales. Libérées après destruction du virus, elles entraînent la formation d’anticorps.
La protéine p24 est la protéine majeure de la capside. La p17 est la protéine de la matrice qui réalise la connexion entre la capside et l’enveloppe externe.

 Le génome

Le virus VIH possède 2 brins d’ARN identiques, comportant environ 9200 paires de bases, associés à des molécules de transcriptase inverse et à d’autres protéines enzymatiques

Le cycle de réplication du virus

L’enveloppe du virus se fixe à la surface d’une cellule sur une protéine de la membrane cellulaire CD4 (présente sur les lymphocytes T4 et les macrophages en particulier) qui lui sert de porte d’entrée. Une fois dans la cellule, le virus perd son enveloppe, libérant ainsi son noyau. Une enzyme virale, la transcriptase inverse permet à l’ARN du virus de se transformer en ADN et ainsi d’intégrer le noyau de la cellule, lui aussi formé d’ADN. Le noyau de la cellule considère désormais le matériel génétique du virus comme le sien et son activité biologique va être détournée au profit du virus. La cellule va donc se mettre à synthétiser en priorité de nouveaux ARN viraux et des protéines virales qui permettront la formation de nouveaux virus.

La technique ELISA permet la détection d’anticorps anti-VIH dans le sérum sanguin (d’où le terme de séropositivité ou de séronégativité). La technique présente une grande sensibilité (c’est-à-dire que la plupart des cas sont détectés, et que les « faux négatifs » - les tests négatifs alors que le patient est en réalité séropositif - sont très rares, du moins si le test est réalisé dans un délai de trois mois après le contact infectant) et une spécificité acceptable (c’est-à-dire un taux assez faible de « faux positifs »). Toutefois, en cas de sérologie anti-VIH positive, les échantillons seront soumis à des tests de confirmation, comme le western blot, dont le taux d’erreur est quasi-nul.

Partie 3 : Protocoles expérimentaux

Ces protocoles ont été mis en oeuvre dans le cadre du projet européen Comenius « The game of protein ».

Ces protocoles utilisent le kit ELISA de la société Biorad ref 166-2400

Réactifs individuels nécessaires :

Antigène	IgG de poulet	ref 1662406
Anticorps primaire	Anticorps de lapin anti IgG de poulet	ref 1662407
Anticorps secondaire	Anticorps de mouton anti-anticorps de lapin conjugué à l’HRP	ref 1662408
Substrat de l’HRP		ref 1662402
Tampon PBS
Tampon de lavage	Tampon PBS Tween