Le but de la manipulation est de transformer une souche d’E Coli K12 avec un plasmide (pGLO) contenant deux gènes d’intérêts, l’un pour la sélection et l’autre pour la mise en évidence de la transformation par synthèse de GFP :
un gène de résistance à l’ampicilline ;
un gène codant pour la GFP.
La GFP synthétisé sera ensuite extraite par chromatographie (TP2) puis caractérisé par électrophorèse (TP3)
Eléments de Principe
Principe de la production de GFP par E Coli
Protocole de TP
Exemples de questionnement
Autour du principe :
Définir un plasmide
Définir la transformation
Justifier la composition du milieu de transformation
A quoi sert le choc thermique
Quels sont les caractères acquis par les bactéries transformées ?
Citer les deux autres types de transferts de matériels génétiques
Autour de la manipulation
Questionnement préalable
Quels résultats attendez vous ?
| Plasmide | +pGLO | +pGLO | -pGLO | -pGLO |
|---|---|---|---|---|
| Milieu de culture | LB/amp | LB/amp/ara | LB/amp | LB |
| Résultats attendus |
Sur quel(s) milieu(x) allez vous trouver des colonies de E Coli semblables à celles initialement utilisées pour la transformation ?
Sur quelle(s) boite(s) de Pétri allez vous trouver des cellules bactériennes transformées ?
Quels milieux pourront être comparés pour déterminer si une transformation bactérienne a bien eu lieu ?
Quelles différences observez vous entre les résultats des boites +pGLO/LB/amp et +pGLO/LB/amp/ara ?
Quelles sont les boites de Pétri qui servent de contrôle dans ce test ? Que contrôlent-elles ?
Analyses des résultats obtenus
Dresser un tableau de résultats en indiquant le nombre, la couleur, la fluorescence des colonies.
Décrire l’observation de la solution plasmidique pGLO
Quel est le nombre total de cellules fluorescentes déposées sur le milieu +pGLO/LB/amp/ara ?
Sachant que sur ce milieu l’équivallent de 0,16µg d’ADN plasmidique ont été déposé, calculer l’efficacité de la transformation (Nbre de transformation/µg d’ADN)