La conservation à -18°C du levain est le protocole classiquement utilisé dans les brasseries. Il offre l’avantage de permettre une bonne récupération mais présente cependant l’inconvénient de conserver les levains sur un temps limité.
L’optimisation de la conservation présente donc un intérêt et doit répondre à diverses exigences :
une conservation longue,
un faible coût,
un pourcentage de revivification élevé et un pourcentage de viabilité supérieur à 80 %.
Recherche du protocole de conservation optimal
Démarche mise en œuvre :
La vérification et l’optimisation des conditions de revivification d’un levain congelé a été réalisé en testant la revivification des souches obtenues après :
réfrigération à 4°C,
congélation à -18°C,
congélation à -80°C,
ultracongélation à -196°C.
Le levain a été placé dans des cryotubes Microbank. Ils se composent de billes poreuses permettant la fixation des levures et d’un cryoprotecteur : le glycérol. Ce dernier empêche la cristallisation de l’eau qui pourrait détruire les levures.
Voir le protocole d’utilisation des cryotubes Microbank :
En pratique, on détourne ce protocole de façon à permettre quantitativement une comparaison entre plusieurs protocoles :
A partir d’une culture de Saccharomyces cerevisiae diluée en eau physiologique, vérifier que l’on dispose d’une suspension comprise entre 0,2 à 1 uA.
Ensemencer un cryotube « test » en mesurant de façon précise le volume de suspension introduit pour obtenir la densité Mac Farland nécessaire.
→ ce volume sera utilisé pour inoculer à l’identique l’ensemble des cryotubes.
Dans notre exemple, il a fallu introduire 85 microlitres de suspension à 0,48 uA dans le cryotube pour atteindre 3 Mac Farland.
Les 4 cryotubes ensemencés chacun avec 85 microlitres de la suspension ont été stockés pendant 2 semaines avant de tester la revivification.
Après les deux semaines de stockage, sortir les tubes de leur lieu de conservation et laisser décongeler (le cas échéant) à 4°C.
Pour tester la revivification, dans une série de 4 tubes de 1,5 mL de bouillon Sabouraud, placer dans chaque tube 5 cryobilles provenant de chaque protocole testé. Homogénéiser pendant 2 min, puis placer en pré-incubation pendant 2 heures à 30°C.
Après préincubation, réaliser pour chaque bouillon des dilutions décimales jusqu’à 10-2 en eau physiologique stérile. Ensemencer les dilutions en surface en double essai sur gélose Sabouraud. Incuber 48h à 30°C puis réaliser la numération.
Résultats obtenus :
Les tests de revivification sont réalisés en prenant comme référence les résultats obtenus pour le protocole standard à -18°C : la concentration en levures obtenues correspond arbitrairement à 100% de revivification. Les valeurs obtenues pour les autres protocoles sont calculées théoriquement par rapport à cette référence. Le tableau présenté ci-dessous présente les différents résultats obtenus :
Pourcentage de revivification obtenus pour différents procédés de cryoconservation
| Procédé de conservation | Nbre de levures par mL (en levures/mL) | Pourcentage de revivification (en %) |
| Congélation -18°C (protocole de référence) | 54000 | 100 |
| Réfrigération 4°C | 72000 | 133 |
| Congélation -80°C | 88000 | 163 |
| Ultracongélation -196°C | 19000 | 35 |
Interprétation des résultats :
Ultracongélation -196°C : La conservation des souches à une telle température entraîne une revivification inférieure au protocole de référence. En effet, à cette température une partie des levures sont tuées, seules les cellules les plus résistantes survivent. De plus, l’installation (congélation dans l’azote liquide) représente un coût élevé pour l’entreprise. L’ultracongélation est donc à exclure.
Réfrigération 4°C : Bien que présentant un pourcentage de revivification (133 %) supérieur à la référence, ce protocole de conservation présente un inconvénient majeur, à 4°C les levures ont encore un métabolisme actif, bien que ralentit, donc leur croissance se poursuit. Donc, ce protocole permet une conservation de très courte durée.
Congélation -80°C : Le congélateur à -80°C représente un investissement certain pour l’industriel. Le pourcentage de revivification de 163 % et le temps de conservation supérieur au protocole de référence, semblent être des arguments de poids pour ce procédé. En conclusion, il offre le meilleur compromis (voir figure III ci-dessous).
Contrôle de la viabilité après congélation
Après congélation à -80°C, on réalise un dénombrement des levures, visant à déterminer le pourcentage de viabilité du levain. Ce pourcentage traduit le nombre de levures vivantes par rapport au nombre de levures totales récupérées. Pour les besoins de la production, le pourcentage de viabilité doit être supérieur à 80%. Lors des analyses, nous avons effectivement démontré que le pourcentage était supérieur à 80 %.
Conclusion : Le procédé de cryoconservation retenu est la congélation à -80°C. Ce procédé permet une excellente viabilité du levain. Il présente des avantages et des inconvénients présentés ci-dessous
