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Contrôles de pureté, de stabilité et de résistance d'un levain de brasserie

O Beaumesnil — 2012-05-30T19:36:09Z

Ces contrôles visent à démontrer l'absence de contamination par des bactéries en montrant la pureté du levain et que celui-ci correspond bien à Saccharomyces cerevisiae, en étudiant ses caractéristiques morphologiques et biochimiques. Une fois la souche validée, il est nécessaire de vérifier ses capacités de croissance : pour cela on déterminera ses paramètres cinétiques de croissance de façon à vérifier qu'elle est apte à se développer dans le cadre d'une bioproduction.

Démarche mise en œuvre

A partir d'une suspension de levain, on réalise successivement :
un ensemencement sur gélose Sabouraud (pour vérifier la pureté de la souche),
un ensemencement d'une galerie API 20C AUX (pour vérifier ses caractéristiques biochimiques),
une observation au microscope optique du levain (pour vérifier ses caractéristiques morphologiques).
un test de développement en fermenteur de laboratoire (pour déterminer les paramètres cinétiques).
un test de résistance aux levures « killer » (pour vérifier la non sensibilité du levain aux contaminants extérieurs).

Ensemencement sur gélose Sabouraud :

L'ensemencement est réalisé par isolement sur un milieu gélose en boîte de Pétri.

Voir ci-dessous une vidéo de la technique d'ensemencement d'une gélose en boîte de Pétri :

Après incubation 24h à 30°C :

L'observation macroscopique des colonies montre la présence d'un seul type de colonies présentant les caractéristiques suivantes : couleur blanchâtre et aspect bombé et crémeux. Sur gélose Sabouraud, ces caractères sont représentatifs des levures. De plus, une odeur de levures de brasserie et/ou de boulanger confirme l'analyse. La souche est pure.

Observation au microscope optique :

L'observation du levain montre la présence de cellules de forme ovoïde avec des bourgeonnements. Ces deux éléments montrent respectivement qu'il s'agit de levures et qu'elles sont dans une dynamique de croissance.

Ensemencement d'une galerie API 20C AUX

La galerie API 20C AUX constitue un outil permettant de vérifier l'identité d'une levure en étudiant ses caractères biochimiques.

Téléchargez la fiche d'utilisation de la galerie API 20C Aux (source : Bio-Mérieux)

Procédure API 20C Aux

Voir ci-dessous une vidéo de l'utilisation d'une galerie API :

La galerie API 20C AUX comporte 20 tests où chaque cupule permet d'étudier l'auxotrophie de la souche vis à vis d'un glucide présent dans la cupule.

Définition de l'auxotrophie : aptitude d'un micro-organisme à se développer en présence d'une source unique de carbone (ici un glucide).

La lecture des différents tests ( + : culture possible en présence du glucide, - : incapacité de la souche à se développer uniquement avec se glucide) permettent d'obtenir un profil, dont les résultats, une fois exploités sur une base de données permettent d'obtenir la correspondance avec le nom du levain.

Exemple de résultats obtenus à l'aide de la base de données en ligne Apiweb :

Le résultat obtenu confirme qu'il s'agit effectivement de la souche Saccharomyces cerevisiae avec une bonne fiabilité de l'identification (98,7%) et une bonne typicité (T=1) de la souche (c'est à dire une bonne correspondance entre le profil de notre souche et le profil théorique connu pour cette souche).

Conclusion : Le levain est une souche pure présentant une morphologie et des caractères biochimiques typiques de Saccharomyces cerevisiae.

Vérification des paramètres cinétiques de croissance

Le contrôle des paramètres cinétiques de la souche de levure décongelée, constitue une étape importante pour l'industriel. En effet, pour lui assurer des rendements convenables, le levain doit présenter un temps de génération convenable (le temps de génération est le temps nécessaire pour doubler le nombre de levures lors de leur croissance). On réalisera donc une étude complète de la croissance du levain en fermenteur.

Les fermenteurs de laboratoire sont des enceintes, généralement en verre permettant la croissance de micro-organismes, en contrôlant différents paramètres (agitation, température, pH, oxygénation).

Exemple de fermenteur de laboratoire :

Démarche mise en œuvre :

Une cuve de fermentation de 10 litres est ensemencée avec Saccharomyces cerevisiae dans un milieu analogue à celui utilisé pour fabriquer la bière (moût de fermentation à base de malt). On dénombre les levures au cours du temps au fur et à mesure de la croissance. Par exploitation graphique et des calculs, on peut alors déterminer la vitesse spécifique de croissance (Qx) et le temps de génération (G).

Voir l'animation ci-dessous pour modéliser les résultats d'une courbe de croissance en fermenteur (cocher graphe ln X = f(t), puis cliquez sur « Démarrer »)

Source : http://www.biomultimedia.net

Exemples de résultats obtenus avec le levain et interprétation :

Courbe de croissance : ln N levures/mL = f (t en minutes)

La phase exponentielle de croissance (ici surlignée en pointillés) est la zone permettant une exploitation numérique de résultats. L'équation de la droite en phase exponentielle, nous permet de déterminer la vitesse spécifique de croissance Qx.
Ici, après exploitation de ces résultats, on obtient :
Qx (correspondant au coefficient directeur) = 0,0069 min-1
soit un G = ln 2/Qx = ln 2 / 0,0069 = 100 min

Notre levain présente donc un temps de génération de 100 min, c'est le temps qu'il met pour doubler sa population. Ce temps de génération est satisfaisant au regard des exigences de productivité.

Conclusion : Les paramètres cinétiques du levain étudié sont convenables et permettront d'obtenir un rendement de production convenable pour la brasserie.

Vérification de la sensibilité aux levures « killer »

Les levains de brasserie peut-être soumis à diverses contaminations extérieures, notamment par des levures dites « killer » qui peuvent détruire les levains et ainsi nuire à une bioproduction.

Les levures de brasserie peuvent être classées en 3 catégories :
les levures « killer » qui libèrent une toxine pouvant détruire les autres levures,
les levures « sensibles » qui sont tuées par cette toxine,
les levures « neutres » qui ne produisent pas de toxine et qui y sont indifférentes.

Démarche mise en œuvre :

Le protocole consiste à mettre en présence sur milieu gélosé, le levain a étudier avec d'une part une souche test reconnue sensible, et d'autre part une souche reconnue « killer ».

Le protocole est résumé dans le logigramme ci-dessous :

Résultats obtenus et interprétation :

Les résultats des deux tests figurent ci-dessous :

Levain + Levures « killer » :
La souche « killer » s'est développée normalement sur l'ensemble de la gélose, elle a donc libérée ses toxines. Notre levain, déposé sur la strie centrale, s'est aussi développé. Notre levain n'est donc pas sensible.

Levain + Levures « sensibles » :
Le levain sur la strie centrale s'est développé normalement, tout comme les levures « sensibles ». La croissance des levures "sensibles n'a pas été inhibée par une quelconque toxine. Notre levain ne produit donc pas de toxine.

Conclusion : Le levain de brasserie est « neutre » : il est donc très intéressant pour la réalisation de la bioproduction car sera résistant aux contaminations extérieures par les levures killer.

Conclusion générale : le levain a été qualifié par les différents tests réalisés, il peut maintenant être produit pour ensuite être utilisé pour mettre en oeuvre un brassage

Processus de fabrication de la bière

F Colomb — 2012-05-30T19:35:56Z

Matières premières

Le malt qui est de l'orge germé et transformé (au moins 50% matières amylacées ou sucrées mises en œuvre).
Sans dépasser 30% du mélange, riz, semoule de maïs, grains d'orge non germés, sucre et glucose.
Du houblon et ses composés terpéniques qui permettent d'apporter l'amertume, de conférer un pouvoir antiseptique surtout vis-à-vis des Gram+ et de stabiliser la mousse.
De l'eau
Des auxiliaires de fabrication et/ou des additifs alimentaires comme du Ca2+ qui favorisent la multiplication de la levure et activent les enzymes, du caramel qui intensifie la coloration de la bière...

Fabrication

Le maltage se fait en malterie. Il produit du malt c'est-à-dire de l'orge germé. Cette étape se divise en
une hydratation de l'orge,
la germination proprement dite qui se fait en 4 jours en aération, à température et humidité contrôlée
le touraillage par des courants d'air chaud 70 à 200°C, qui a pour but de stopper la germination, d'induire les réactions de coloration et la production d'arômes, et de sécher malt.
le dégermage : repos du malt

Le maltage à pour but le développement des enzymes, alpha et
béta-amylases au sein de la céréale.

Le brassage à deux objectifs l'hydrolyse de l'amidon du malt, c'est l'étape de saccharification et l'addition de cônes femelles de houblon, c'est l'étape d'houblonnage.

Cette étape se divise en :
Concassage du malt
Brassage dans de grands récipients. La mise en suspension ou « empâtage » se fait dans l'eau à 40-50°C dans une grande cuve ronde que l'on appelle « malaxeur à maische » ou « cuve-matière ». La liquéfaction du brassin se fait en élevant la température vers 62-64°C.
Filtration pour éliminer les résidus insolubles ou « drèches », qui sont destinées à l'alimentation du bétail, et donner le jus sucré appelé moût.
Cuisson et houblonnage par ébullition prolongée (1 à 2h) qui inactive les enzymes et stérilise le moût suivie d'une une seconde filtration.
Le moût est enfin refroidi à 6°C avant ensemencement.

La fermentation est déclenchée par l'ensemencement par des levures du genre Sacharomyces parfaitement caractérisées et provenant de laboratoires. Les oses et les diholosides vont subir la fermentation alcoolique.

On distingue la fermentation principale (99% des sucres fermentescibles) qui peut se faire par :
la fermentation basse (la plus répandue), à 10-15°C, pendant une semaine environ, par l'espèce Sacharomyces carlbergensis La levure se dépose au fond des cuves (basse).
la fermentation haute (bières anglaises de type « ale »), en 3 à 4 jours à 20-25°C par Sacharomyces cerevisiae, qui reste en surface (haute).
la fermentation spontanée à température ambiante par des ferments contenus dans l'air ambiant (cas des lambics belges)

Puis la fermentation secondaire ou de garde dans des tanks hermétiques durant 3 à 8 semaines à une température abaissée à 0-1°C. Les objectifs sont de :
fermenter les 1% de sucres fermentescibles restant et saturer la bière en dioxyde de carbone
laisser décanter les levures et les matières en suspension
réaliser la maturation à l'abri de l'oxygène de l'air pour éviter l'oxydation de la bière ;
affiner la flaveur de la bière.

Une filtration finale est réalisée pour amener la bière à un trouble mesurable de 0,5 à 0,7 unité EBC (Bière brillante) suivie souvent d'une pasteurisation à 65°C (pasteurisation basse). Cette pasteurisation est remplacée de plus en plus par l'ultrafiltration.

Le conditionnement se fait avec du dioxyde de carbone sous pression, récupéré lors de la fermentation.

Schéma récapitulatif

Ci dessous une animation présentant les différentes étapes de fabrication de la bière

source : http://www.passioncereales.fr/

Optimisation de la revivification d'un levain après conservation

F Colomb, O Beaumesnil — 2012-05-30T19:35:42Z

La conservation à -18°C du levain est le protocole classiquement utilisé dans les brasseries. Il offre l'avantage de permettre une bonne récupération mais présente cependant l'inconvénient de conserver les levains sur un temps limité.

L'optimisation de la conservation présente donc un intérêt et doit répondre à diverses exigences :
une conservation longue,
un faible coût,
un pourcentage de revivification élevé et un pourcentage de viabilité supérieur à 80 %.

Recherche du protocole de conservation optimal

Démarche mise en œuvre :
La vérification et l'optimisation des conditions de revivification d'un levain congelé a été réalisé en testant la revivification des souches obtenues après :
réfrigération à 4°C,
congélation à -18°C,
congélation à -80°C,
ultracongélation à -196°C.

Le levain a été placé dans des cryotubes Microbank. Ils se composent de billes poreuses permettant la fixation des levures et d'un cryoprotecteur : le glycérol. Ce dernier empêche la cristallisation de l'eau qui pourrait détruire les levures.

Voir le protocole d'utilisation des cryotubes Microbank :

Procédure Microbank

En pratique, on détourne ce protocole de façon à permettre quantitativement une comparaison entre plusieurs protocoles :

A partir d'une culture de Saccharomyces cerevisiae diluée en eau physiologique, vérifier que l'on dispose d'une suspension comprise entre 0,2 à 1 uA.

Ensemencer un cryotube « test » en mesurant de façon précise le volume de suspension introduit pour obtenir la densité Mac Farland nécessaire.
→ ce volume sera utilisé pour inoculer à l'identique l'ensemble des cryotubes.
Dans notre exemple, il a fallu introduire 85 microlitres de suspension à 0,48 uA dans le cryotube pour atteindre 3 Mac Farland.

Les 4 cryotubes ensemencés chacun avec 85 microlitres de la suspension ont été stockés pendant 2 semaines avant de tester la revivification.

Après les deux semaines de stockage, sortir les tubes de leur lieu de conservation et laisser décongeler (le cas échéant) à 4°C.
Pour tester la revivification, dans une série de 4 tubes de 1,5 mL de bouillon Sabouraud, placer dans chaque tube 5 cryobilles provenant de chaque protocole testé. Homogénéiser pendant 2 min, puis placer en pré-incubation pendant 2 heures à 30°C.

Après préincubation, réaliser pour chaque bouillon des dilutions décimales jusqu'à 10-2 en eau physiologique stérile. Ensemencer les dilutions en surface en double essai sur gélose Sabouraud. Incuber 48h à 30°C puis réaliser la numération.

Résultats obtenus :

Les tests de revivification sont réalisés en prenant comme référence les résultats obtenus pour le protocole standard à -18°C : la concentration en levures obtenues correspond arbitrairement à 100% de revivification. Les valeurs obtenues pour les autres protocoles sont calculées théoriquement par rapport à cette référence. Le tableau présenté ci-dessous présente les différents résultats obtenus :

Pourcentage de revivification obtenus pour différents procédés de cryoconservation

Procédé de conservation	Nbre de levures par mL (en levures/mL)	Pourcentage de revivification (en %)
Congélation -18°C (protocole de référence)	54000	100
Réfrigération 4°C	72000	133
Congélation -80°C	88000	163
Ultracongélation -196°C	19000	35

Interprétation des résultats :
Ultracongélation -196°C : La conservation des souches à une telle température entraîne une revivification inférieure au protocole de référence. En effet, à cette température une partie des levures sont tuées, seules les cellules les plus résistantes survivent. De plus, l'installation (congélation dans l'azote liquide) représente un coût élevé pour l'entreprise. L'ultracongélation est donc à exclure.

Réfrigération 4°C : Bien que présentant un pourcentage de revivification (133 %) supérieur à la référence, ce protocole de conservation présente un inconvénient majeur, à 4°C les levures ont encore un métabolisme actif, bien que ralentit, donc leur croissance se poursuit. Donc, ce protocole permet une conservation de très courte durée.

Congélation -80°C : Le congélateur à -80°C représente un investissement certain pour l'industriel. Le pourcentage de revivification de 163 % et le temps de conservation supérieur au protocole de référence, semblent être des arguments de poids pour ce procédé. En conclusion, il offre le meilleur compromis (voir figure III ci-dessous).

Contrôle de la viabilité après congélation

Après congélation à -80°C, on réalise un dénombrement des levures, visant à déterminer le pourcentage de viabilité du levain. Ce pourcentage traduit le nombre de levures vivantes par rapport au nombre de levures totales récupérées. Pour les besoins de la production, le pourcentage de viabilité doit être supérieur à 80%. Lors des analyses, nous avons effectivement démontré que le pourcentage était supérieur à 80 %.

Conclusion : Le procédé de cryoconservation retenu est la congélation à -80°C. Ce procédé permet une excellente viabilité du levain. Il présente des avantages et des inconvénients présentés ci-dessous

Bioproduction d'un levain de brasserie et mise en oeuvre d'une fabrication de bière

O Beaumesnil — 2012-05-30T19:33:30Z

Bioproduction préalable d'un levain de brasserie

Intérêt de la bioproduction de levain

Lors de la fabrication d'une bière, le moût houblonné doit être ensemencé avec une certaine quantité de levures pour lancer le mécanisme de fermentation alcoolique. Une bioproduction de levain va alors permettre de produire des levures en quantité suffisante pour lancer la fabrication de la bière.

Conditions opératoires de la bioproduction

Saccharomyces cerevisiae possède la faculté de produire son énergie par deux mécanismes différents en fonction des conditions environnementales :
- le métabolisme oxydatif (en présence d'oxygène) : qui permet la production de biomasse par croissance de la levure et la transformation du glucose en CO2,
- le métabolisme fermentatif (en absence d'oxygène) favorise la fermentation alocoolique et donc la production d'éthanol.

La manipulation consistera donc en une culture discontinue en fermenteur, en aérobiose (présence d'oxygène), de Saccharomyces cerevisiae. L'objectif est ici d'avoir un rendement de production de biomasse satisfaisant, c'est-à-dire en favorisant le métabolisme oxydatif. En effet pour cette étape préliminaire, c'est l'obtention du levain en quantité qui importe.

La culture est réalisée en fermenteur de laboratoire, avec les conditions suivantes :
température = 30°C
milieu de culture = bouillon Sabouraud glucosé
alimentation en air = 3 VVM (volume d'air par volume de milieu par min)
agitation 300 rpm

Exemple de fermenteur de laboratoire :

Au fur et à mesure du développement de la souche, on suit à chaque temps :
l'évolution de la concentration en levures, afin de s'assurer de l'accroissement de la biomasse,
la concentration en glucose du milieu de culture, afin de s'assurer que la souche utilise bien ce substrat,
la concentration en éthanol qui doit rester proche de zéro, signifiant ainsi que la souche n'utilise que son métabolisme oxydatif, pas le fermentatif.

Voir l'animation ci-dessous pour modéliser les résultats d'une courbe de croissance en fermenteur (cocher graphe ln X = f(t), puis cliquez sur « Démarrer »)

Source : http://www.biomultimedia.net

Résultats de la bioproduction de levain

Courbe de suivi de la production de biomasse , du glucose et de l'éthanol :

L'analyse de cette courbe montre que :
la souche se développe convenablement au cours du temps avec une vitesse spécifique de croissance de 0,0069 min-1 (obtenu par le coefficient directeur de la droite de régression en phase exponentielle de croissance),
ceci est en relation avec la disparition du glucose au cours du temps, celui étant dégradé par la souche,
l'objectif de production de biomasse est atteint : en effet la non apparition d'éthanol tout au long de la croissance montre que seul le métabolisme oxydatif a été utilisé par la souche.

Lors de l'arrêt de la production, nous avions dans le fermenteur :
une concentration en levures de 5x10^9 levures /L,
soit une concentration massique en levures de 5 g/L (par correspondance avec la masse d'une cellule de levure = 1 ng en moyenne)
donc avec un volume de milieu de 2 L, nous avions 10 g de levures.

En conditions, aseptiques, le milieu de culture est récupéré dans des bouteilles de 1L qui sont ensuite stockées au froid. Ensuite la biomasse doit être préparée soigneusement :
sédimentation des levures,
élimination du liquide surnageant,
rinçage à l'eau physiologique stérile,
sédimentation + élimination des eaux de rinçage, à répéter 3 fois.

La biomasse ainsi obtenue peut être utilisée pour le brassage.

Fabrication de la bière

Principe de fabrication de la bière

La fabrication de la bière se décompose en 5 étapes illustrées ci-dessous :

Pour réaliser notre brassage nous utilisons un extrait de malt houblonné prêt à l'emploi qui permet d'éviter les étapes de maltage, de saccharification et d'aromatisation. En pratique seules les étapes de fermentation primaire et secondaire seront mises en oeuvre.

La fermentation primaire est l'étape durant laquelle le levain de brasserie converti la majorité des sucres en éthanol et en CO2 grâce ) une fermentation alcoolique.

Voir l'article sur le processus de fabrication de la bière pour plus de détails.

A la fin de la fermentation primaire, on obtient une « bière verte » peu mousseuse et peu pétillante que l'on soutire. Pour exalter les arômes, on poursuit le procédé par la maturation durant laquelle une fermentation secondaire a lieu. Les levures encore vivantes vont achever la fermentation des sucres restants (moins de 1% des sucres de départ) en permettant alors d'affiner le goût et d'accumuler du CO2 pour rendre la bière pétillante.

Production de la bière

Les principales étapes de la production de la bière sont résumées ci-dessous :

La fermentation primaire dure entre 8 et 15 jours. Lorsqu'elle est achevée, la bière « verte » peut alors être soutirée et embouteillée. La maturation permettra d'obtenir en 8 à 10 semaines une bière consommable.

Suivi de fermentation et contrôles microbiologiques

Pendant les 8 à 15 jours de la fermentation primaire, un suivi quotidien de la cuve de brassage est réalisé. On suit :
l'évolution de la teneur en éthanol
l'évolution de la composition en glucides

Suivi de la teneur en éthanol

La fermentation primaire pouvant durer entre 8 à 15 jours, un suivi de la teneur en éthanol est mis en place afin de déterminer l'instant où il faut arrêter la fermentation. Ce suivi consiste à mesurer la densité du moût de fermentation, car celle-ci est équivalente à la teneur en éthanol présente. On considère qu'une fermentation primaire est achevée lorsque la densité est comprise entre 1,005 et 1,010, correspondant à un degré alcoolique de 3 à 4°.

Démarche mise en œuvre :

Chaque jour, un opérateur prélève une quantité suffisante de moût de fermentation dans une éprouvette pour mesurer la densité à l'aide d'un densimètre :

Résultats des mesures :

Jour|Densité mesurée|
1|1,03|
2|1,03|
3|1,02|
4|1,02|
5|1,02|
6|1,01|
7|1,01|
8|1,00|
9|1,00|

Les résultats montre une diminution de la densité jusqu'au seuil de 1,00, la fermentation primaire a donc permis la formation d'éthanol. Ici on obtient au bout de 8 jours une densité inférieure à 1,01 : la fermentation primaire est achevée.

Suivi de la composition glucidique

Un autre suivi permet de contrôler le bon déroulement de la fermentation. Il s'agit de suivre la composition en sucres du moût, puisque les sucres sont consommés par le levain. Ce suivi a été réalisé par chromatographie sur couche mince comme le présente la figure ci-dessous. L'échantillon de moût est systématiquement placé au centre de chaque plaque, les autres dépôts de part et d'autre sont des sucres témoins.

Exemples de chromatogrammes obtenus aux jours 1, 2 et 9 de la fermentation primaire :

Au jour 1, le moût de fermentation est composé essentiellement de sucres complexes de grande taille (maltose, saccharose par exemple). On les repère sur ce chromatogramme par le spot bleu formant une longue traînée.

Le chromatogramme obtenu lors du jour 2, montre qu'à ce stade le moût est composé principalement de sucres moins complexes de plus petite taille (glucose, fructose par exemple). On les repère par le spot rond de couleur violet intense spot rond de couleur violet intense. Ces sucres sont apparus par transformation des sucres complexes en sucres plus simples.

Au jour 9, l'échantillon ne montre pas de spots nettement visibles : il y a finalement quasiment disparition des sucres. En effet, les sucres simples ont pu être assimilés quasi-totalement par le levain et consommés lors de la fermentation alcoolique : ils sont donc maintenant à l'état de traces dans le moût.

Contrôles microbiologiques

Avant le soutirage, on prélève du moût afin de vérifier l'absence de bactéries pathogènes. Pour cela, on a ensemencé les milieux suivants :
une gélose Chapman spécifique de Staphylococcus aureus,
une gélose ColiID permettant la recherche de coliformes et de Escherichia coli,
et enfin une gélose SmID pour recherches les salmonelles.

Le contrôle microbiologique de la bière a démontré l'absence de toute contamination. Le soutirage du produit peut-être réalisé.

Conclusion

La fabrication d'une bière nécessite préalablement une production de levain pour obtenir un nombre suffisant de levures, qui réaliseront la fermentation alcoolique nécessaire au développement des caractéristiques gustatives du produit. Le suivi et les contrôles microbiologiques ont démontré l'innocuité du produit, qui peut alors maturé pendant plusieurs semaines pour affiner le goût de la bière...avant de pouvoir la consommer.