Séries ST2S, STL biotechnologies

La synthèse des protéines in vivo et in vitro

F Colomb — 2011-10-05T18:58:00Z

Ce diaporama a été présenté par le Prof Dr Baron lors du meeting Comenius de Hambourg de septembre 2011.

Principe de l'électrophorèse SDS-PAGE et de la détermination de la masse moléculaire d'une protéine (Diaporama en anglais)

Présentation et comparaison de la synthèse des protéines in vivo et in vitro (Diaporama en anglais)

Cet article fait partie du dossier « Production in vitro de la GFP », mise en oeuvre dans le projet européen Comenius « The game of protein ».

Production in vitro de la GFP

F Colomb — 2011-10-05T18:47:23Z

Cet article fait partie du dossier « Détermination de la masse molaire de la GFP », mise en oeuvre dans le projet européen Comenius « The game of protein ».

Voici en quelques diapos et vidéos une présentation de la manipulation avec une première partie sur l'expression in vitro du gène de la GFP, puis une seconde sur l' analyse des protéines par SDS-PAGE

Récupération de la plaque de gel Préparation de la plaque de gel Préparation de la cuve d'électrophorèse Remplissage de la cuve d'électrophorèse Remplissage des puits du gel Mise en route de l'électrophorèse Démoulage du gel

Bioinformatique et GFP (1/2)

F Colomb — 2011-03-27T18:22:35Z

Ce TD fait parti du dossier sur la protéine fluorescente verte GFP (Green Fluorescent Protein) dont vous retrouverez le sommaire à cette adresse.

Cette première partie va permettre de découvrir la structure de la protéine. Une deuxième partie sera consacrée à la séquence d'ADN codant pour cette protéine.

Structure de la GFP

1. Trouver une stucture protéique dans une banque de données de protéines

Connectez vous au site de la banque de données de protéines de Research Collaboratory for Structural Bioinformatics (RCSB)

http://www.pdb.org

Tapez le terme « green fluorescent protein » dans la barre de recherche située en haut de page et validez.

Choisir « Generate reports » puis « Image collage ».

Que remarquez vous ? Existe t'il qu'une seule molécule de GFP ?

Vous pouvez alors explorer différentes structures en cliquant sur les vignettes.

2. Exploration du squelette de la protéine

Pour la suite de l'exercice nous allons utiliser la GFP extraite de la meduse Aequorea victoria 1EMA.
La recherche se fait de la même façon en tapant le terme « 1EMA » dans la barre de recherche puis en validant.

Dans la partie droite de la page, vous observez l'image de la protéine avec dessous un certain nombre d'outils de visualisation. Certains fonctionnent avec la présentation « biological Assembly », d'autres avec « Asymetric Unit ».

Choisir « Asymetric Unit » puis « Other Viewers » et « QuickPDB ».
La fenêtre suibvante apparaît.

Vous retrouvez la séquence d'acides aminés dans le haute de la fenêtre et la structure spatiale de la protéine dans le bas.
Vous pouvez sélectionner des résidus d'acides aminés pour voir leur positionnement dans la molécule, manipuler la structure 3D avec la souris.
Toute mauvaise manipulation peut être annulée en cliquant sur le bouton « Reset ».

Combien de résidus d'acides aminés composent cette protéine ?

Quel sont les acides aminés en position 50, 100, 150 et 200 ?

Sélectionner le résidu 64 et glisser la souris sur le résidu suivant pour sélectionner les deux.

Quels sont ces deux résidus ? Quel est le n° du résidu après le n°64 ? Dans la structure de la protéine, sont ils liés ? Ou se situent-ils ?

3. Exploration de la structure secondaire de la protéine

Retourner à la page de départ en cliquant sur l'onglet « Summary ».
Sous l'image de la molécule, cliquez sur « Protein WorkShop ».
Acceptez l'ouverture du fichier proposé.

A gauche se situe la fenêtre de visualisation et à droite les commandes.
Vous pouvez, en vous aidant de la souris faire subir des rotations et des translations à la molécule et zoomer sur celle-ci.

Aller sur l'onglet « ShortCuts » et essayer de colorer les hélices alpha en bleu, les feuillets béta en rouge, les coudes béta en vert et les parties non structurées en gris. Changez la couleur de l'arrière plan en blanc.

En allant sur l'onglet « Options », enregistrer l'image de votre GFP.

Observez et déterminez le nombre de structures secondaires :
hélice alpha
feuillets beta
coude béta

4. Emplacement du groupement chromophore

Sur l'onglet « Tools » :
choisissez « Colors » -> ""Ribbons" -> « Active color en blanc » -> puis dans la boite 4 cliquez sur « ChainA ». Votre protéine doir apparaître en blanc.
choisissez « Visibility » -> « Atoms and Bonds » -> puis dans la boite 4 développer la séquence de la chaine A en cliquant sur le triangle situé à gauche du nom. Cliquez ensuite sur le résidu A66CRO. Le chromophore apparait sur la figure.

En allant sur l'onglet « Options », enregistrer l'image de votre GFP.

Ou se situe le chromophore au niveau de la structure spatiale de la protéine ?

5. Visualisation des liaisons H

Pour les observer, fermez la fenêtre de "Protein workshop et retournez au sommaire de la Protéine Data Bank sur la fiche de la GFP. Sous l'image cliquez sur « View in Jmol ».

Dans la boite de dialogue sous l'image choisissez :
style « Cartoon » ou « Backbone »
color « by chain »
surface « none »
puis sélectionnez la case « H-Bonds »

Les liaisons hydrogène apparaissent.

Ou se situent la grande majorité d'entre elles ? Essayez d'en déduire leur rôle.

Référence :

Fondé sur « Bioinformatics of Green Fluorescent Protein » du RSCB : Research Collaboratory for Structural Bioinformatics

Fichier complet à télécharger à cette adresse :
http://www.rcsb.org/pdb/education_discussion/educational_resources/gfp-bioinformatics-tutorial-summer2010.pdf

Production de GFP par E Coli

F Colomb — 2011-03-27T18:01:01Z

Le but de la manipulation est de transformer une souche d'E Coli K12 avec un plasmide (pGLO) contenant deux gènes d'intérêts, l'un pour la sélection et l'autre pour la mise en évidence de la transformation par synthèse de GFP :
un gène de résistance à l'ampicilline ;
un gène codant pour la GFP.

La GFP synthétisé sera ensuite extraite par chromatographie (TP2) puis caractérisé par électrophorèse (TP3)

Eléments de Principe

Principe de la production de GFP par E Coli

Protocole de TP

Transformation d'Ecoli K12 par le plasmide pGLO

Exemples de questionnement

Autour du principe :

Définir un plasmide
Définir la transformation
Justifier la composition du milieu de transformation
A quoi sert le choc thermique
Quels sont les caractères acquis par les bactéries transformées ?
Citer les deux autres types de transferts de matériels génétiques

Autour de la manipulation

Questionnement préalable

Quels résultats attendez vous ?

Plasmide	+pGLO	+pGLO	-pGLO	-pGLO
Milieu de culture	LB/amp	LB/amp/ara	LB/amp	LB
Résultats attendus

Sur quel(s) milieu(x) allez vous trouver des colonies de E Coli semblables à celles initialement utilisées pour la transformation ?
Sur quelle(s) boite(s) de Pétri allez vous trouver des cellules bactériennes transformées ?
Quels milieux pourront être comparés pour déterminer si une transformation bactérienne a bien eu lieu ?
Quelles différences observez vous entre les résultats des boites +pGLO/LB/amp et +pGLO/LB/amp/ara ?
Quelles sont les boites de Pétri qui servent de contrôle dans ce test ? Que contrôlent-elles ?

Analyses des résultats obtenus

Dresser un tableau de résultats en indiquant le nombre, la couleur, la fluorescence des colonies.
Décrire l'observation de la solution plasmidique pGLO
Quel est le nombre total de cellules fluorescentes déposées sur le milieu +pGLO/LB/amp/ara ?
Sachant que sur ce milieu l'équivallent de 0,16µg d'ADN plasmidique ont été déposé, calculer l'efficacité de la transformation (Nbre de transformation/µg d'ADN)

Principe de la production de GFP par E Coli

F Colomb — 2011-03-27T17:01:00Z

Télécharger le diaporama au format Power Point :

Détermination de la masse moléculaire de la GFP

F Colomb — 2011-01-26T15:13:50Z

Cet article fait partie du dossier « Détermination de la masse molaire de la GFP », mise en oeuvre dans le projet européen Comenius « The game of protein ».

Voici en quelques diapos et vidéos une présentation de la manipulation de détermination la masse moléculaire de la GFP

Principe électrophorèse SDS-PAGE

F Colomb — 2011-01-26T14:41:06Z

Ce diaporama a été présenté par le Prof Dr Baron lors du meeting Comenius de Pforzheim de janvier 2011.

Principe de l'électrophorèse SDS-PAGE et de la détermination de la masse moléculaire d'une protéine (Diaporama en anglais)

Principe de l'électrophorèse SDS-PAGE et de la détermination de la masse moléculaire d'une protéine (Diaporama en anglais)

Cet article fait partie du dossier « Détermination de la masse molaire de la GFP », mise en oeuvre dans le projet européen Comenius « The game of protein ».

Présentation de la GFP

F Colomb — 2011-01-25T11:34:38Z

Cet article fait partie du dossier « Détermination de la masse molaire de la GFP », mise en oeuvre dans le projet européen Comenius « The game of protein ».

Ce diaporama est basé sur la présentation du Dr Baron effectuée lors du meeting Comenius de février 2011, qui est téléchargeable à cette adresse :

IMG/comenius/GFP.pps

La GFP - Introduction

F Colomb — 2011-01-25T11:34:22Z

Le Prix Nobel de Chimie 2008 a été attribué au japonais Osamu Shimomura et aux américains Martin Chalfie et Roger Y. Tsien pour la découverte et le développement de la protéine fluorescente verte GFP (Green Fluorescent Protein).

Osamu Shimomura découvre la GFP

En 1962, Shimomura isole de la méduse Aequorea victoria une protéine qui fluoresce dans la couleur verte lorsqu'elle est soumise à une lumière UV : la GFP. Il montre que cette protéine possède un chromophore particulier, c'est-à-dire un groupe chimique qui absorbe et émet de la lumière.
Ainsi quand on soumet la GFP à une lumière UV le chromophore de la GFP passe dans un état excité puis restitue cette énergie en émettant un photon afin de revenir à son état fondamental ; cette désexcitation se réalise dans la longueur d'onde du vert.

Martin Chalfie utilise la GFP comme traceur

En 1990, après isolement du gène codant pour la GFP, Chalfie et son équipe injectent ce gène au sein de la bactérie Escherichia Coli qui se met à produire de la GFP. La bactérie E. Coli brille alors d'un vert intense quand elle est irradiée par une lumière UV.

En 1994, l'étape suivante est l'insertion de ce gène au niveau des neurones impliqués dans la perception tactile du ver C. elegans. Les résultats sont publiés dans le journal « Science » en Février 1994, sur la couverture apparaissent alors lesdits neurones illuminés d'une couleur verte intense.
Cette méthode non invasive se multipliera dans les années à venir pour l'observation interne du vivant microscopique.

Roger Y. Tsien créé une palette de couleur de la GFP

Tsien développe des GFP capables d'émettre plus longtemps, plus intensément, et à des couleurs différentes. L'énorme intérêt de cette découverte est la faculté de pouvoir suivre simultanément le trajet de différentes protéines en affectant à chaque protéine une couleur différente. Ainsi, Tsien facilite par cette innovation l'étude des interactions entre protéines.
Il s'intéresse donc au chromophore de la GFP, que l'on sait être formé des trois acides aminés en position 65-66-67. Par des échanges astucieux des différents acides aminés de la GFP, Tsien et son équipe parviennent à créer des variantes de la GFP émettant dans différentes teintes de bleu, de jaune et de rouge.

Une expérience impressionnante, nommée "the brainbow" (brain -cerveau- et rainbow -arc-en-ciel) et publiée dans Nature en 2007, consiste en la modification génétique des cellules nerveuses du cerveau d'une souris afin qu'elles produisent différentes couleurs. Elle montre la possibilité de suivre les fibres nerveuses à partir de différentes cellules individuelles au sein du réseau dense du cerveau de la souris.

Référence :

http://nobelprize.org/nobel_prizes/chemistry/laureates/2008/info.html
http://www.conncoll.edu/ccacad/zimmer/GFP-ww/GFP-1.htm
http://www.rcsb.org/pdb/static.do?p=education_discussion/molecule_of_the_month/pdb42_1.html

Cet article fait partie du dossier "Détermination de la masse molaire de la GFP", mise en oeuvre dans le projet européen Comenius « The game of protein ».