Séries ST2S, STL biotechnologies

Biotechnologies et Philosophie : l'alliance des Humanités Scientifiques

Marianne BARAILLE — 2026-02-05T06:36:43Z

Depuis la rentrée 2024, trois BTS de biotechnologies sont concernés par ce nouveau co-enseignement "Humanités Scientifiques".

Cet enseignement des « humanités scientifiques » est d'une heure hebdomadaire en première année des BTS Biotechnologie en recherche et en production (BTS BioRP) et en BTS Bioanalyses en laboratoire de contrôle (BTS BioALC), et d'une heure hebdomadaire en deuxième année de BTS de Biologie médicale (BTS BM).
Dans les trois BTS, il est pris en charge conjointement par un enseignant de biotechnologies en Biochimie génie biologique (BGB) et par un enseignant de philosophie.

L'enseignement des « humanités scientifiques » s'inscrit dans les blocs de compétences professionnelles.

Ses visées sont à la fois pratiques et théoriques :

pratiques puisqu'il s'agit de former à un comportement professionnel et d'améliorer les relations en laboratoire des étudiants et jeunes professionnels ;
théoriques puisqu'il s'agit de réfléchir aux enjeux des métiers visés par ces formations.

De manière plus générale, à l'horizon, cet enseignement a pour but de développer une réflexion éthique et philosophique sur les pratiques scientifiques et responsabilités professionnelles, en développant l'esprit critique des étudiants, en les sensibilisant aux questions éthiques liées aux biotechnologies, et en les préparant à l'expression orale de ces problématiques dans le cadre de leur futur métier et de leurs épreuves certificatives.

La lettre Edunum n°18 PHILOSOPHIE très complète sur le thème "Philosophie et BTS de Biologie Rénovés" offre des ressources pédagogiques et une interview croisée des Inspectrices Générales, Mmes Paula La Marne, Sabine Carotti et Morgane Le Bras-Caraboeuf sur cette thématique.

Lettre eduNum « Philosophie et BTS de Biologie rénovés »

Continuité pédagogique ressources : activité technologique sur les tests diagnostiques du Covid-19 en BTS ABM

Marianne BARAILLE — 2020-05-08T19:03:37Z

Cette activité technologique « Tests diagnostiques du Covid-19 », proposée par Mme Lesellier (Lycée Littré, Avranches), a pour objectif de faire un point très précis sur les méthodes utilisées en laboratoire pour détecter l'infection par le Covid-19 (méthodes sérologiques et méthodes moléculaires par quantitative Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction = qRT-PCR).

Elle est destinée aux étudiants de 2^ème année de BTS Analyses de Biologie médicale (ABM), mais peut être utilisée comme ressources en BTS Bioanalyses et contrôles (BioAC) et BTS Biotechnologies.

Une AT qui permet donc de consolider les compétences des étudiants prochainement diplômés.

Voici le contenu de l'AT « Tests diagnostiques du Covid-19 »

AT Tests diagnostiques du Covid-19

et son corrigé

Corrigé AT Tests diagnostiques du Covid-19

Mes remerciements à Mme Tiphaine LESELLIER pour sa contribution.

Electrophorèse SDS PAGE : principe et exemple d'application en STL Biotechnologies

O Beaumesnil — 2012-06-12T18:28:13Z

L'objectif de cet article est de :
recenser quelques ressources (vidéos, animations, diaporamas...) permettant d'appréhender le principe de cette technique électrophorétique,
présenter des ressources en anglais permettant d'envisager une utilisation dans la cadre de la LV technologique de section STL Biotechnologies,
présenter un exemple d'application pratique en STL Biotechnologies, portant sur l'identification variétale de protéines de tissu musculaire de poisson.

Principe et mise en oeuvre de la SDS-PAGE

L'électrophorèse SDS-PAGE (électrophorèse en gel de polyacrylamide contenant du dodécysulfate de sodium) est une technique consistant à faire migrer des protéines dans un gel, sous l'influence d'un champ électrique, permettant ainsi leur séparation.

Voir le diaporama de présentation de la SDS-PAGE (en anglais) utilisé au lycée Senghor lors de l'échange Comenius sur la protéomique :

SDS-PAGE Principle

La manipulation nécessite :
une cuve à électrophorèse + un générateur électrique,
un gel de polyacrylamide (précoulé en cassette ou à préparer) contenant des puits pour dépôt,
des solutions tampons adaptées au gel.

Le gel de polyacrylamide est créé par la polymérisation d'acrylamide et de bis-acrylamide, en présence d'agents de polymérisation (TEMED, persulfate d'ammonium par exemple). Plus la concentration en acrylamide est élevée, plus les pores seront petits et plus les molécules seront freinées dans le gel.

Comme toute technique électrophorétique, la SDS-PAGE permet la séparation des particules se fait en fonction de leur charge électrique et pour des charges identiques, en fonction de leur taille.
Dans le cas de la SDS-PAGE, la séparation est réalisée en conditions dénaturantes en raison de l'ajout de SDS (dodécylsulfate de sodium) : le SDS est un détergent fort possédant une longue queue hydrocarbonée hydrophobe et une extrémité chargée négativement. Il intéragit avec les protéines par sa portion hydrocarbonée en liant leurs régions hydrophobes. En se liant à la protéine, le SDS empêche son repliement et lui confère une charge nette négative.
La structure native de la protéine est donc dénaturée, et une charge apparente négative est alors conférée à la protéine.

En présence de SDS, les protéines auront donc toutes une charge apparente négative, elles migreront donc toutes vers l'anode. Cela signifie que seul le poids moléculaire des protéines sera le facteur de leur séparation. Les protéines ayant un petit poids moléculaire, seront moins retenues dans les pores du gel de polyacrylamide et migreront donc plus loin que les grosses.

Remarque : on ajoute aussi très souvent au mélange dénaturant du 2-mercaptoéthanol. Ce composé réduit les pont disulfures unissant les différentes sous-unités des protéines oligomériques. Chaque sous-unité, une fois dissociée, fixe le SDS et prend une charge apparente négative. Les sous-unités étant dissociées, sur le gel, apparaitrons après migration, autant de bande qu'il y avait de sous-unités constitutives.

Exemple de simulation animée d'une électrophorèse SDS-PAGE :

Choisissez la masse moléculaire des protéines étalons A, B, C et D, puis cliquer sur « START » et immédiatement après sur « STRAIN » pour visualiser la progression des protéines dans le gel. A tout moment il est possible d'appuyer sur « STOP » pour arrêter la progression :

Source : www.winona.edu

Réalisation d'une électrophorèse SDS-PAGE

Les protéines, préalablement traitées en conditions dénaturantes, sont tout d'abord condensées dans un gel de concentration puis séparées dans un gel de séparation. Lorsque les protéines ont été séparées, leur révélation sur le gel peut être effectuée en les colorant directement (Bleu de Coomassie par exemple). Cette coloration permet de visualiser toutes les protéines dans l'échantillon dont la concentration dépasse la limite de détection de la coloration. Le gel coloré au bleu de Coomassie peut être ensuite transparisé par un mélange méthanol/acide acétique/eau.

Voir ci-dessous en vidéo (en anglais) les différentes étapes de progression des protéines au sein d'un gel :

Source : www.geened.com

Exemple de gel après coloration au bleu de Coomasie :

Exemple d'application pratique en STL Biotechnologies : identification variétale de poisson par caractérisation de protéines du tissu musculaire

Intérêt de la manipulation

Grâce à la SDS-PAGE, il est possible de déterminer assez finement la présence d'une protéine donnée dans un échantillon protéique. Une protéine sera caractérisée par une masse moléculaire donnée.
L'objectif de la séance est de caractériser, chez un poisson, une protéine du tissu musculaire, l'actine, qui est impliquée dans les mécanismes de contraction musculaire. Dans chaque variété de poissons, on retrouvera des forme d'actine ayant des caractéristiques précises, permettant ainsi de comparer des variétés entre-elles : on parle d'identification variétale. Il est ainsi possible de comparer entre-elles les protéines de différentes variétés d'une espèce en comparant leurs masses moléculaires.

Dans la séance proposée nous testerons deux échantillons :

un échantillon de référence, constitué par du tissu de saumon sauvage,
un échantillon de saumon à tester commercialisé comme étant d'origine sauvage.
Les saumons d'élevage, souvent croisés avec des truites, ayant des caractéristiques sensiblement différentes des saumons sauvages, nous allons vérifier, par comparaison de leur actine, que le saumon commercialisé comme étant d'origine sauvage, n'est pas un poisson d'élevage.

Protocole et matière d'oeuvre à télécharger :

Exemple de protocole

Exemples d'exploitation possibles :

Questions de compréhension :
Justifier le rôle des différents constituants du tampon Laemmli. Justifier le rôle du bleu de Coomassie, puis de l'étape de transparisation sous l'eau.

Proposer un schéma légendé et annoté du montage électrophorétique et expliquer le rôle des différents éléments.

Repérer sur le gel les bandes correspondant à l'actine.

Expliquer les différences de migration observées pour les différentes protéines du mélange étalon.

Tracer la courbe d'étalonnage (log masse moléculaire en kDa = f (distance de migration à l'aide de l'outil informatique.

A l'aide de la courbe d'étalonnage, déterminer la masse moléculaire de l'actine des deux variétés de poissons testés et conclure sur l'origine du saumon testé.

Des bonbons au laboratoire !

N Bergère — 2012-05-31T13:37:14Z

Des confiseries gélifiées en forme d'ourson très appréciées des enfants ont la composition suivante :
« Sirop de glucose, Sucre, Gélatine, Acidifiant : acide citrique, Dextrose, Jus de fruits concentrés, Arômes »

Trois objectifs de séquences au laboratoire sont définis :

application de la chromatographie d'exclusion moléculaire à la séparation des constituants du bonbon gélifié avec contrôle de l'efficacité de la séparation par le dosage des protéines et du glucose,
dosage de l'acidité du bonbon
contrôle de la composition en sucres et en protéines de ces confiseries annoncée sur l'emballage :

Protéines	6,2 g pour 100 g
Sucres	78 g pour 100 g

La gélatine est une protéine animale extraite, après hydrolyse, de matières premières riches en collagène.

Trois matières premières sont utilisées pour obtenir industriellement la gélatine :
Les couennes de porc toujours traitées par hydrolyse acide et conduisant donc à des gélatines de type A,
Les peaux de bovin toujours traitées par hydrolyse alcaline et conduisant donc à des gélatines de type B,
Les os qui peuvent être de type A ou B.

Que l'hydrolyse ait été réalisée en milieu acide ou en milieu alcalin, la gélatine est ensuite extraite à l'eau chaude à des températures croissantes.
Viennent alors des opérations de filtration, désionisation, concentration, stérilisation, gélification, extrusion, séchage, et broyage permettant d'obtenir le produit fini.

Procédés de fabrication de la gélatine alimentaire (source Adrianor)

Après dissolution dans l'eau chaude et refroidissement, la gélatine forme un gel qui présente de nombreux avantages pour des applications alimentaires :

il est très clair, et cette transparence est recherchée notamment dans les confiseries,
il est réversible, c'est à dire qu'il fond lorsqu'il chauffe au delà d'une température dite point de fusion qui se situe entre 27 et 35°C, ce qui est intéressant quand on recherche une fusion en bouche.

La formation du gel va dépendre :
de la gélatine elle-même (degré bloom),
de la durée et de la température : le gel se forme immédiatement à 10°C, mais il faut environ 16 heures pour atteindre la gélification maximale,
et de la concentration en gélatine : elle doit être de 0,8 % minimum pour qu'il y ait gélification, c'est ce qu'on appelle la concentration critique de gélification.

Exemples d'utilisation de la gélatine :

Un grand nombre de produits alimentaires contiennent de la gélatine. Elle est utilisée comme épaississant, stabilisant ou agent texturant dans des produits comme les confiseries, les crèmes glacées, les confitures, les yaourts, la margarine, les gateaux… Elle est également utilisée dans les produits allégés pour stimuler la sensation de gras en bouche et créer du volume sans ajouter de calories.
Dans l'industrie pharmaceutique, la gélatine est l'un des principaux constituants des gélules contenant des médicaments. Dans l'industrie cosmétique elle fait partie de la composition de certaine crème.

Séparation des constituants du bonbon gélifié par chromatographie d'exclusion moléculaire

La gélatine alimentaire utilisée pour la préparation de ces confiseries est le seul constituant macromoléculaire entrant dans la composition. Il est donc possible d'effectuer la purification de la gélatine de l'échantillon par chromatographie d'exclusion moléculaire (ou gel-filtration) sur gel de Séphadex® G-25.

Le domaine de fractionnement de ce gel est de 1000 à 5000 g/mol. La gélatine sera donc totalement exclue de ce gel alors que les autres molécules suffisamment petites (glucose, saccharose, acide citrique…) pourront pénétrer dans les mailles du réseau moléculaire du gel et parcourront un chemin plus long que les grosses molécules de gélatine qui ne pénètrent pas dans le gel : toutes ces petites molécules seront donc éluées plus tardivement.

Principe de la chromatographie d'exclusion

Ce type de chromatographie est encore appelé : tamisage moléculaire, gel-filtration ou perméation de gel.

Cette technique permet la séparation des molécules en fonction de leur taille et de leur forme. On utilise pour cela des granules de gel poreux.

Les grosses molécules (dont le diamètre est supérieur à celui des pores) sont exclues et sont donc éluées les premières, au niveau du volume mort ( Vm ou V0 ). Les petites et moyennes molécules sont éluées plus tardivement, car incluses dans le gel, leur migration est freinée.

Les solutés sont donc élués dans l'ordre inverse des masses moléculaires. Il existe une relation linéaire entre le volume d'élution et le logarithme de la masse moléculaire.

Voici deux animations expliquant le principe de la chromatographie d'exclusion :

source : http://www.geniebio.ac-aix-marseille.fr/bioch/docs/tamisage.html

source : http://www.austincc.edu/biocr/index.html

Séparation des constituants des bonbons

Fiche protocole n°1	Fiche protocole n°2	Fiche technique GE Healthcare
Préparation de l'échantillon pour les analyses	Séparation de la gélatine par exclusion moléculaire	Colonne HiTrap Desalting

Dosage de la gélatine et des sucres des bonbons et obtention du profil chromatographique

Fiche protocole n°3	Fiche protocole n°4	Fiche technique BioMérieux
Dosage de la gélatine par la méthode de Biuret	Dosage du glucose par méthode enzymatique en point final	Kit RTU Glucose

Analyses possibles autour des manipulations :

En utilisant l'outil informatique, tracer la courbe d'étalonnage A lue à 540 nm = f ( masse de gélatine dans tube ).
Valider les points expérimentaux et donner les paramètres de la droite de régression.
Calculer la concentration en gélatine de l'échantillon « B ».
En déduire la teneur des bonbons gélifiés en pourcentage en masse et comparer à la valeur annoncée.
Tracer le profil d'élution de la gélatine.
Calculer la masse de gélatine récupérée dans chaque fraction analysée.
En déduire le rendement de récupération de la gélatine au cours de la chromatographie.
Calculer la concentration en glucose de l'échantillon « B ».
Grâce au dosage de l'hydrolysat « H », calculer la concentration en saccharose de l'échantillon « B ».
En déduire la teneur en glucose et saccharose des bonbons gélifiés en pourcentage en masse et comparer à la valeur annoncée.*
Tracer le profil d'élution du glucose.
Calculer la masse de glucose récupérée dans chaque fraction analysée.
En déduire le rendement de récupération du glucose au cours de la chromatographie.
Analyser le profil d'élution ci-dessous :

Dosage volumétrique d'un polyacide : l'acide citrique

Fiche technique n°5

Détection d'OGM dans un aliment

Catherine Chauvin, F Colomb — 2012-05-20T10:14:05Z

Cet article vous présente une méthode de détection d'OGM dans un aliment par PCR et électrophorèse d'ADN.

Les organismes génétiquement modifiés
Détection d'OGM dans un aliment et technique PCR

Protocoles expérimentaux

Partie 1 : Les organismes génétiquement modifiés

Vous pouvez retrouver à cette adresse une série d'affiche sur le thème des OGM réalisées par les étudiants de 2ème année du BTS Bioanalyses et Contrôles du lycée Léopold Sédar Senghor d'Evreux dans le cadre de la fête de la science 2010 dont le thème principal concernait la biodiversité.

Définition

Un organisme génétiquement modifié (OGM) est un organisme (animal, végétal, bactérie) dont on a modifié le matériel génétique par une technique dite de génie génétique pour lui conférer une caractéristique nouvelle.

Les techniques modernes de génie génétique, consistent à introduire un ou plusieurs gènes dans le patrimoine génétique d'un organisme et de construire des organismes dits "génétiquement modifiés". Ces techniques permettent de transférer des gènes sélectionnés d'un organisme à un autre, y compris entre des espèces différentes. Elles offrent ainsi la possibilité d'introduire dans un organisme un caractère nouveau.

Les applications du génie génétique concernent différents domaines :

Dans le domaine médical de nombreuses applications liée à la transgénèse sont rencontrées :

Les productions pharmacologiques : des dizaines de molécules sont fabriquées par des cellules transgéniques, y compris d'origine végétale : de nombreuses hormones (insuline, hormone de croissance), des anticorps ou encore des vaccins (vaccin contre le cancer du col del'utérus par exemple).

L'homme OGM ou la thérapie génique : méthode thérapeutique, pour l'heure expérimentale, qui repose sur une idée simple : si un gène est responsable d'une maladie, il suffit de remplacer le gène défectueux
par le gène intact pour guérir la maladie.

De nombreuses études sont en cours pour envisager le traitement de
cancers, de maladies neurodégénératives (Alzheimer…) ou encore
des maladies acquises comme par exemple la mucoviscidose

Dans le domaine agricole, des plantes génétiquement modifiées, telles que le maïs, le soja ou le coton possédant des propriétés de résistance à des insectes ravageurs des cultures, ou de tolérance à certains herbicides ainsi que des plantes résistantes à certaines maladies, sont commercialisées et cultivées dans certains pays.

Des plantes tolérantes à des conditions de stress environnemental telles que la sécheresse, la salinité, le froid, sont en cours de développement ou à l'étude.

Dans le domaine environnemental, des recherches sont conduites sur des plantes ou des micro-organismes permettant de dépolluer les sols contaminés et plus généralement d'éliminer les contaminants de l'environnement. Ces applications sont encore au stade de la recherche.

Par exemple des peupliers transgéniques sont utilisés pour réhabiliter d'anciennes friches industrielles : ils permettent de dépolluer des sols contaminés par des métaux toxiques, en les stockant dans leurs racines…

Dans l'industrie qui utilise de plus en plus fréquemment des OGM pour faciliter leurs processus de fabrication ou améliorer les rendements.

Par exemple dans l'industrie du papier, des arbres issus de plants
transgéniques sont utilisés. Tout en conservant leurs caractéristiques physiologiques, ces arbres donnent en industrie papetière de meilleurs rendements et un papier de meilleure qualité.

Des maïs, des betteraves sucrières ou de la canne à sucre génétiquement modifiés permettent d'obtenir de forts rendements en éthanol pour la production de biocarburant…

Dans le domaine de l'alimentation, de nouveaux aliments possédant des caractéristiques telle que l'enrichissement du riz en vitamine A ou en fer, permettant de lutter contre les maladies liés à des carences alimentaires, ou une modification en acides gras des huiles afin de limiter les risques de maladies cardiovasculaires, sont en cours de développement ou d'étude.

Comment les obtient-on ?

La possibilité de fabriquer un OGM repose sur le fait que l'ADN est de même nature pour tous les organismes vivants.

De ce fait, il est possible de transférer un gène d'un organisme donneur à un organisme receveur totalement différent. L'organisme receveur exprimera alors un caractère porté par le gène transféré issu de l'organisme donneur.

La figure ci-dessous présente les techniques de création d'une plante génétique. D'autres techniques peuvent être utilisées dans le cas des animaux et des micro-organismes.

Source : http://www.ogm.org

Source : http://www.ogm.org

Les gènes contiennent des signaux qui régulent leur expression. Ces signaux ne sont souvent pas compris par les cellules d'un autre organisme. Ainsi lors de l'étape d'intégration il faut modifier le gène de manière à ce que les cellules de la plante le lisent correctement et fabriquent la protéine d'intérêt. Il s'agit en particulier de modifier deux sites du gène :
le promoteur qui sert de site de fixation de l'ARN polymérase et de signal pour démarrer la transcription d'un gène ;
le terminateur, signal qui stoppe la transcription.

Le promoteur le plus couramment utilisé dans les cultures OGM est le promoteur 35S du vrus de la mosaïque du chou-fleur (CaMV 35S) qui par nature active la transcription dans tous les types de cellules végétales. Le terminateur est quant à lui celui de la nopaline synthase (NOS) provenant de Agrobactérium tumefaciens.

Partie 2 : Détection d'OGM dans un aliment et technique PCR

En Europe les aliments ne nécessitent un étiquetage particulier que s'ils contiennent une teneur en OGM > 1%.
Comment tester des aliments (ou des produits agricoles) pour savoir ceux qui contiennent des OGM ?

Deux méthodes sont actuellement utilisées :
la technique ELISA (Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay) qui identifie les protéines. Mais cette technique ne peut être utiliser que sur des produits frais, les protéines étant dégradées avec le temps et les traitements des aliments.
la seconde utilise la technique de PCR (Polymerase Chain Reaction) qui identifie les séquences d'ADN qui ont été insérées dans l'OGM.

De plus, alors qu'un test ELISA est spécifique d'une protéine donc d'un OGM, un seul test PCR peut mettre en évidence de nombreux OGM qui aurait intégrer le même promoteur et/ou terminateur dans leur construction.

Principe de la PCR

La « Polymerase Chain Reaction » ou PCR est une technique d'amplification génique in vitro. Elle permet d'obtenir, à partir d'un échantillon complexe et peu abondant, d'importantes quantités d'un fragment d'ADN spécifique et de longueur définie.

Le principe est de réaliser une succession de réactions de réplication d'une matrice double brin d'ADN. Chaque réaction met en oeuvre deux amorces oligonucléotidiques (ou « primers » en anglais) qui définissent alors, en la bornant, la séquence à amplifier (amplicon).

Quels sont les acteurs de la PCR :
l'ADN à amplifier,
des amorces, spécifiques du segment d'ADN voulu,
de la Taq polymérase (ADN polymérase thermostable)
du mélange des quatre désoxyribonucléotides constitutifs de l'ADN.

La PCR est ensuite une répétition cyclique de trois phases différentes à trois températures différentes : la dénaturation, l'hybridation et l'élongation.

Voici en deux animations le principe de la PCR expliqué :

Source : http://www.snv.jussieu.fr (Universite Pierre et Marie Curie - Paris)

Source : http://www.mheducation.com (Mac Graw Hill Education)

Réalisez une PCR grâce au laboratoire virtuel de PCR Cliquez sur l'image

Source : http://lifesciences.envmed. rochester.edu (Université de Rochester)

Partie 3 : Détection d'OGM dans un aliment : protocole

La technique employée utilisant une amorce pour le promoteur CaMV 35S et une pour le terminateur NOS, elle permet de détecter 85% des produits végétales modifiés génétiquement.

Protocole

Résultats et diagramme d'analyses des gels

Ce protocole utilisent le kit GMO Investigator de la société Biorad ref 166-2501

Méthodes ELISA et Test HIV

F Colomb — 2012-05-17T18:36:30Z

Cet article vous présente une méthode immunoenzymatique utilisée pour le dépistage des personnes séropositives au HIV (virus du SIDA). A la fin de cet article un protocole de dépistage vous est proposé.

La méthode ELISA
VIH et technique de dépistage

Protocoles expérimentaux

Partie 1 : La méthode ELISA

La méthode immuno-enzymatique ELISA (de l'anglais Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) qui correspond donc à un dosage immuno-enzymatique sur support solide, est un examen courant de laboratoire.

Cette méthode est principalement utilisée en immunologie pour détecter la présence d'un anticorps ou d'un antigène dans un échantillon.

L'ELISA est une technique biochimique utilisant un ou deux anticorps. L'un de ceux-ci est spécifique de l'antigène, tandis que l'autre réagit avec les complexes antigène-anticorps et est couplé à une enzyme. Cet anticorps secondaire, responsable du nom de la technique, permet, en présence d'un substrat chromogène, l'émission d'un signal par la production d'un produit coloré détectable voir quantifiable.

Voici deux animations expliquant le principe général d'une méthode ELISA

ELISA - Source : http://www.sumanasinc.com/

ELISA - Source :http://www.mheducation.com/home/index.shtml

L'ELISA pouvant être utilisé tant pour évaluer la présence d'un antigène que celle d'un anticorps dans un échantillon, c'est un outil efficace à la fois pour déterminer des concentrations sériques d'anticorps (comme pour le test HIV), que pour détecter la présence d'un antigène. Il a également trouvé des applications dans l'industrie alimentaire, pour détecter des allergènes alimentaires.

Ce test entre dans le cadre plus général des EIA (enzyme immunoassays), dans lequel le dosage est couplé à une réaction catalysée par une enzyme qui libère un composant coloré suivi par une spectroscopie, par opposition aux RIA (radio immunoassays) dans lesquels l'anticorps est marqué par un radioélément et dont le dosage mesure un nombre de désintégrations par secondes.

Ci dessous un document présentant la diversité des méthodes utilisables.

Diversité des méthodes ELISA

Partie 2 : VIH et technique de dépistage

Le virus de l'immunodéficience humaine (VIH) est un rétrovirus infectant l'homme et responsable du syndrome d'immunodéficience acquise (SIDA), qui est un état affaibli du système immunitaire le rendant vulnérable à de multiples infections opportunistes.

Transmis par plusieurs fluides corporels : sang, sécrétions vaginales, sperme ou lait maternel, le sida est aujourd'hui considéré comme une pandémie ayant causé la mort de plus de 25 millions de personnes entre 1981 et aujourd'hui.

Bien qu'il existe des traitements antirétroviraux luttant contre le VIH et retardant par conséquent l'apparition du SIDA, réduisant ainsi la mortalité, il n'existe à l'heure actuelle aucun vaccin ou traitement définitif. La prévention, qui passe notamment par les rapports sexuels protégés et la connaissance de son statut sérologique de manière à éviter les infections d'autrui, est le moyen de lutte le plus efficace.

Structure du virus

Le virus du VIH apparaît en microscopie électronique comme une particule sphérique de 80 à 120 nanomètres de diamètre.

L'enveloppe externe

Elle est composée de lipides issus des cellules humaines et de protéines virales qui traversent cette membrane lipidique :
— La protéine gp120 qui se fixe spécifiquement sur les protéines CD4 des lymphocytes et des macrophages.
— La protéine gp 41 participe à la fusion entre l'enveloppe virale et la membrane phospholipidique de la cellule.

La capside

Elle est faite de protéines virales. Libérées après destruction du virus, elles entraînent la formation d'anticorps.
La protéine p24 est la protéine majeure de la capside. La p17 est la protéine de la matrice qui réalise la connexion entre la capside et l'enveloppe externe.

Le génome

Le virus VIH possède 2 brins d'ARN identiques, comportant environ 9200 paires de bases, associés à des molécules de transcriptase inverse et à d'autres protéines enzymatiques

Le cycle de réplication du virus

L'enveloppe du virus se fixe à la surface d'une cellule sur une protéine de la membrane cellulaire CD4 (présente sur les lymphocytes T4 et les macrophages en particulier) qui lui sert de porte d'entrée. Une fois dans la cellule, le virus perd son enveloppe, libérant ainsi son noyau. Une enzyme virale, la transcriptase inverse permet à l'ARN du virus de se transformer en ADN et ainsi d'intégrer le noyau de la cellule, lui aussi formé d'ADN. Le noyau de la cellule considère désormais le matériel génétique du virus comme le sien et son activité biologique va être détournée au profit du virus. La cellule va donc se mettre à synthétiser en priorité de nouveaux ARN viraux et des protéines virales qui permettront la formation de nouveaux virus.

La technique ELISA permet la détection d'anticorps anti-VIH dans le sérum sanguin (d'où le terme de séropositivité ou de séronégativité). La technique présente une grande sensibilité (c'est-à-dire que la plupart des cas sont détectés, et que les « faux négatifs » - les tests négatifs alors que le patient est en réalité séropositif - sont très rares, du moins si le test est réalisé dans un délai de trois mois après le contact infectant) et une spécificité acceptable (c'est-à-dire un taux assez faible de « faux positifs »). Toutefois, en cas de sérologie anti-VIH positive, les échantillons seront soumis à des tests de confirmation, comme le western blot, dont le taux d'erreur est quasi-nul.

Partie 3 : Protocoles expérimentaux

Ces protocoles ont été mis en oeuvre dans le cadre du projet européen Comenius « The game of protein ».

Protocoles en français

Documents de présentation en français

Protocoles en anglais

Documents de présentation en anglais

Ces protocoles utilisent le kit ELISA de la société Biorad ref 166-2400

Réactifs individuels nécessaires :

Antigène	IgG de poulet	ref 1662406
Anticorps primaire	Anticorps de lapin anti IgG de poulet	ref 1662407
Anticorps secondaire	Anticorps de mouton anti-anticorps de lapin conjugué à l'HRP	ref 1662408
Substrat de l'HRP		ref 1662402
Tampon PBS
Tampon de lavage	Tampon PBS Tween

Production in vitro de la GFP

F Colomb — 2011-10-05T19:09:31Z

Dans le cadre du projet européen Comenius « The Game of Protein » qui vous est présenté à cette adresse, une des manipulations réalisées est la production in vitro de GFP.

Vous trouverez :
un article d'introduction sur la GFP
un diaporama de présentation de la GFP
un diaporama de présentation de la synthèse des protéines in vivo et in vitro
un diaporama de présentation du principe de l'électrophorèse SDS-PAGE
un article présentant au travers d'images et de vidéos la manipulation permettant la production de GFP avec une première partie sur l'expression in vitro du gène de la GFP, puis une seconde sur l' analyse des protéines par SDS-PAGE

et pour les étudiants le protocole de réalisation de la manipulation.

Production in vitro de la GFP - Protocole

Cette manipulation est fondée sur le kit « RTS 100 E.coli HY Kit » produit par la société Roche, commercialisé par 5Prime et distribué en France par Dutscher et VWR.

La synthèse des protéines in vivo et in vitro

F Colomb — 2011-10-05T18:58:00Z

Ce diaporama a été présenté par le Prof Dr Baron lors du meeting Comenius de Hambourg de septembre 2011.

Principe de l'électrophorèse SDS-PAGE et de la détermination de la masse moléculaire d'une protéine (Diaporama en anglais)

Présentation et comparaison de la synthèse des protéines in vivo et in vitro (Diaporama en anglais)

Cet article fait partie du dossier « Production in vitro de la GFP », mise en oeuvre dans le projet européen Comenius « The game of protein ».

Production in vitro de la GFP

F Colomb — 2011-10-05T18:47:23Z

Cet article fait partie du dossier « Détermination de la masse molaire de la GFP », mise en oeuvre dans le projet européen Comenius « The game of protein ».

Voici en quelques diapos et vidéos une présentation de la manipulation avec une première partie sur l'expression in vitro du gène de la GFP, puis une seconde sur l' analyse des protéines par SDS-PAGE

Récupération de la plaque de gel Préparation de la plaque de gel Préparation de la cuve d'électrophorèse Remplissage de la cuve d'électrophorèse Remplissage des puits du gel Mise en route de l'électrophorèse Démoulage du gel

Bioinformatique et GFP (1/2)

F Colomb — 2011-03-27T18:22:35Z

Ce TD fait parti du dossier sur la protéine fluorescente verte GFP (Green Fluorescent Protein) dont vous retrouverez le sommaire à cette adresse.

Cette première partie va permettre de découvrir la structure de la protéine. Une deuxième partie sera consacrée à la séquence d'ADN codant pour cette protéine.

Structure de la GFP

1. Trouver une stucture protéique dans une banque de données de protéines

Connectez vous au site de la banque de données de protéines de Research Collaboratory for Structural Bioinformatics (RCSB)

http://www.pdb.org

Tapez le terme « green fluorescent protein » dans la barre de recherche située en haut de page et validez.

Choisir « Generate reports » puis « Image collage ».

Que remarquez vous ? Existe t'il qu'une seule molécule de GFP ?

Vous pouvez alors explorer différentes structures en cliquant sur les vignettes.

2. Exploration du squelette de la protéine

Pour la suite de l'exercice nous allons utiliser la GFP extraite de la meduse Aequorea victoria 1EMA.
La recherche se fait de la même façon en tapant le terme « 1EMA » dans la barre de recherche puis en validant.

Dans la partie droite de la page, vous observez l'image de la protéine avec dessous un certain nombre d'outils de visualisation. Certains fonctionnent avec la présentation « biological Assembly », d'autres avec « Asymetric Unit ».

Choisir « Asymetric Unit » puis « Other Viewers » et « QuickPDB ».
La fenêtre suibvante apparaît.

Vous retrouvez la séquence d'acides aminés dans le haute de la fenêtre et la structure spatiale de la protéine dans le bas.
Vous pouvez sélectionner des résidus d'acides aminés pour voir leur positionnement dans la molécule, manipuler la structure 3D avec la souris.
Toute mauvaise manipulation peut être annulée en cliquant sur le bouton « Reset ».

Combien de résidus d'acides aminés composent cette protéine ?

Quel sont les acides aminés en position 50, 100, 150 et 200 ?

Sélectionner le résidu 64 et glisser la souris sur le résidu suivant pour sélectionner les deux.

Quels sont ces deux résidus ? Quel est le n° du résidu après le n°64 ? Dans la structure de la protéine, sont ils liés ? Ou se situent-ils ?

3. Exploration de la structure secondaire de la protéine

Retourner à la page de départ en cliquant sur l'onglet « Summary ».
Sous l'image de la molécule, cliquez sur « Protein WorkShop ».
Acceptez l'ouverture du fichier proposé.

A gauche se situe la fenêtre de visualisation et à droite les commandes.
Vous pouvez, en vous aidant de la souris faire subir des rotations et des translations à la molécule et zoomer sur celle-ci.

Aller sur l'onglet « ShortCuts » et essayer de colorer les hélices alpha en bleu, les feuillets béta en rouge, les coudes béta en vert et les parties non structurées en gris. Changez la couleur de l'arrière plan en blanc.

En allant sur l'onglet « Options », enregistrer l'image de votre GFP.

Observez et déterminez le nombre de structures secondaires :
hélice alpha
feuillets beta
coude béta

4. Emplacement du groupement chromophore

Sur l'onglet « Tools » :
choisissez « Colors » -> ""Ribbons" -> « Active color en blanc » -> puis dans la boite 4 cliquez sur « ChainA ». Votre protéine doir apparaître en blanc.
choisissez « Visibility » -> « Atoms and Bonds » -> puis dans la boite 4 développer la séquence de la chaine A en cliquant sur le triangle situé à gauche du nom. Cliquez ensuite sur le résidu A66CRO. Le chromophore apparait sur la figure.

En allant sur l'onglet « Options », enregistrer l'image de votre GFP.

Ou se situe le chromophore au niveau de la structure spatiale de la protéine ?

5. Visualisation des liaisons H

Pour les observer, fermez la fenêtre de "Protein workshop et retournez au sommaire de la Protéine Data Bank sur la fiche de la GFP. Sous l'image cliquez sur « View in Jmol ».

Dans la boite de dialogue sous l'image choisissez :
style « Cartoon » ou « Backbone »
color « by chain »
surface « none »
puis sélectionnez la case « H-Bonds »

Les liaisons hydrogène apparaissent.

Ou se situent la grande majorité d'entre elles ? Essayez d'en déduire leur rôle.

Référence :

Fondé sur « Bioinformatics of Green Fluorescent Protein » du RSCB : Research Collaboratory for Structural Bioinformatics

Fichier complet à télécharger à cette adresse :
http://www.rcsb.org/pdb/education_discussion/educational_resources/gfp-bioinformatics-tutorial-summer2010.pdf