Séries ST2S, STL biotechnologies

Des bonbons au laboratoire !

N Bergère — 2012-05-31T13:37:14Z

Des confiseries gélifiées en forme d'ourson très appréciées des enfants ont la composition suivante :
« Sirop de glucose, Sucre, Gélatine, Acidifiant : acide citrique, Dextrose, Jus de fruits concentrés, Arômes »

Trois objectifs de séquences au laboratoire sont définis :

application de la chromatographie d'exclusion moléculaire à la séparation des constituants du bonbon gélifié avec contrôle de l'efficacité de la séparation par le dosage des protéines et du glucose,
dosage de l'acidité du bonbon
contrôle de la composition en sucres et en protéines de ces confiseries annoncée sur l'emballage :

Protéines	6,2 g pour 100 g
Sucres	78 g pour 100 g

La gélatine est une protéine animale extraite, après hydrolyse, de matières premières riches en collagène.

Trois matières premières sont utilisées pour obtenir industriellement la gélatine :
Les couennes de porc toujours traitées par hydrolyse acide et conduisant donc à des gélatines de type A,
Les peaux de bovin toujours traitées par hydrolyse alcaline et conduisant donc à des gélatines de type B,
Les os qui peuvent être de type A ou B.

Que l'hydrolyse ait été réalisée en milieu acide ou en milieu alcalin, la gélatine est ensuite extraite à l'eau chaude à des températures croissantes.
Viennent alors des opérations de filtration, désionisation, concentration, stérilisation, gélification, extrusion, séchage, et broyage permettant d'obtenir le produit fini.

Procédés de fabrication de la gélatine alimentaire (source Adrianor)

Après dissolution dans l'eau chaude et refroidissement, la gélatine forme un gel qui présente de nombreux avantages pour des applications alimentaires :

il est très clair, et cette transparence est recherchée notamment dans les confiseries,
il est réversible, c'est à dire qu'il fond lorsqu'il chauffe au delà d'une température dite point de fusion qui se situe entre 27 et 35°C, ce qui est intéressant quand on recherche une fusion en bouche.

La formation du gel va dépendre :
de la gélatine elle-même (degré bloom),
de la durée et de la température : le gel se forme immédiatement à 10°C, mais il faut environ 16 heures pour atteindre la gélification maximale,
et de la concentration en gélatine : elle doit être de 0,8 % minimum pour qu'il y ait gélification, c'est ce qu'on appelle la concentration critique de gélification.

Exemples d'utilisation de la gélatine :

Un grand nombre de produits alimentaires contiennent de la gélatine. Elle est utilisée comme épaississant, stabilisant ou agent texturant dans des produits comme les confiseries, les crèmes glacées, les confitures, les yaourts, la margarine, les gateaux… Elle est également utilisée dans les produits allégés pour stimuler la sensation de gras en bouche et créer du volume sans ajouter de calories.
Dans l'industrie pharmaceutique, la gélatine est l'un des principaux constituants des gélules contenant des médicaments. Dans l'industrie cosmétique elle fait partie de la composition de certaine crème.

Séparation des constituants du bonbon gélifié par chromatographie d'exclusion moléculaire

La gélatine alimentaire utilisée pour la préparation de ces confiseries est le seul constituant macromoléculaire entrant dans la composition. Il est donc possible d'effectuer la purification de la gélatine de l'échantillon par chromatographie d'exclusion moléculaire (ou gel-filtration) sur gel de Séphadex® G-25.

Le domaine de fractionnement de ce gel est de 1000 à 5000 g/mol. La gélatine sera donc totalement exclue de ce gel alors que les autres molécules suffisamment petites (glucose, saccharose, acide citrique…) pourront pénétrer dans les mailles du réseau moléculaire du gel et parcourront un chemin plus long que les grosses molécules de gélatine qui ne pénètrent pas dans le gel : toutes ces petites molécules seront donc éluées plus tardivement.

Principe de la chromatographie d'exclusion

Ce type de chromatographie est encore appelé : tamisage moléculaire, gel-filtration ou perméation de gel.

Cette technique permet la séparation des molécules en fonction de leur taille et de leur forme. On utilise pour cela des granules de gel poreux.

Les grosses molécules (dont le diamètre est supérieur à celui des pores) sont exclues et sont donc éluées les premières, au niveau du volume mort ( Vm ou V0 ). Les petites et moyennes molécules sont éluées plus tardivement, car incluses dans le gel, leur migration est freinée.

Les solutés sont donc élués dans l'ordre inverse des masses moléculaires. Il existe une relation linéaire entre le volume d'élution et le logarithme de la masse moléculaire.

Voici deux animations expliquant le principe de la chromatographie d'exclusion :

source : http://www.geniebio.ac-aix-marseille.fr/bioch/docs/tamisage.html

source : http://www.austincc.edu/biocr/index.html

Séparation des constituants des bonbons

Fiche protocole n°1	Fiche protocole n°2	Fiche technique GE Healthcare
Préparation de l'échantillon pour les analyses	Séparation de la gélatine par exclusion moléculaire	Colonne HiTrap Desalting

Dosage de la gélatine et des sucres des bonbons et obtention du profil chromatographique

Fiche protocole n°3	Fiche protocole n°4	Fiche technique BioMérieux
Dosage de la gélatine par la méthode de Biuret	Dosage du glucose par méthode enzymatique en point final	Kit RTU Glucose

Analyses possibles autour des manipulations :

En utilisant l'outil informatique, tracer la courbe d'étalonnage A lue à 540 nm = f ( masse de gélatine dans tube ).
Valider les points expérimentaux et donner les paramètres de la droite de régression.
Calculer la concentration en gélatine de l'échantillon « B ».
En déduire la teneur des bonbons gélifiés en pourcentage en masse et comparer à la valeur annoncée.
Tracer le profil d'élution de la gélatine.
Calculer la masse de gélatine récupérée dans chaque fraction analysée.
En déduire le rendement de récupération de la gélatine au cours de la chromatographie.
Calculer la concentration en glucose de l'échantillon « B ».
Grâce au dosage de l'hydrolysat « H », calculer la concentration en saccharose de l'échantillon « B ».
En déduire la teneur en glucose et saccharose des bonbons gélifiés en pourcentage en masse et comparer à la valeur annoncée.*
Tracer le profil d'élution du glucose.
Calculer la masse de glucose récupérée dans chaque fraction analysée.
En déduire le rendement de récupération du glucose au cours de la chromatographie.
Analyser le profil d'élution ci-dessous :

Dosage volumétrique d'un polyacide : l'acide citrique

Fiche technique n°5

Mise au point d'une séparation par HPLC

F Colomb — 2010-01-20T10:33:04Z

Avant de se lancer dans la manipulation proprement dite, il est nécessaire de se poser diverses questions :

De quelles informations disposent-on sur la nature du mélange à analyser (nature, mode de préparation…)
Quelles sont les propriétés physiques et chimiques des composés à séparer (polarité, solubilité, propriétés spectrales…)

Après avoir résolu les problèmes de préparation de l'échantillon et choisit le type de chromatographie (partage, phase réverse, exclusion-diffusion…), la mise au point se fait en 3 étapes :

Obtenir un début de séparation dans un délai acceptable
Ajuster la sélectivité en agissant sur la phase mobile
Optimiser la méthode en influant sur le débit, la taille des particules, la longueur de la colonne, la température…

De manière idéale, les k' doivent être d'environ 2 à 10, mais en pratique ils donnent de bonnes séparations en étant compris entre 1 et 20.

La méthode analytique finale sera telle que tous les pics intéressants seront résolus. C'est à dire que le couple limitant le plus la séparation doit avoir une résolution R de 1,5 ou plus.

Dans la pratique la résolution doit être comprise entre 1,5 et 2. Si la résolution est supérieure à 1,6, le temps d'analyse augmente inutilement. Mais si l'on veut effectuer un grand nombre d'analyses sans avoir de problèmes dus à l'évolution inévitable de la colonne, il vaut mieux voir large sur la valeur minimale de résolution, quitte à perdre un peu de temps dans les premiers chromatogrammes d'une série d'injections.

1. Obtenir un début de séparation

En théorie

En HPLC de phase inverse (réverse) un des éluants est l'eau qui n'interagit pas avec la phase stationnaire (très hydrophobe) et donc ne rentre pas en compétition avec les solutés à séparer pour la fixation sur cette phase mobile.

En phase normale l'eau est le plus couramment remplacé par l'hexane.

Le second éluant d'un mélange binaire est lui appelé « modificateur » et interagit avec la phase stationnaire entrant ainsi en compétition avec les solutés à séparer. Ainsi si la concentration du « modificateur » diminue, les temps de rétention des solutés augmentent et vice versa.

En HPLC de phase inverse, le facteur de capacité est relié à la teneur en solvant organique par une relation de forme :

avec Xs fraction volumique du solvant organique

Remarques :

Ce type d'influence de la phase mobile n'est valable si n'interviennent que des interactions de type hydrophobes. Si d'autres interactions sont en jeu (ioniques, affinités…) cette analyse est très différente.

Il existe aussi des interactions entre solutés à séparer et molécules éluantes qui interviennent sur la qualité de la séparation.

En pratique

Avec des composés inconnus, il est conseillé de travailler en polarité de phase inversée : la phase stationnaire de colonne est généralement une silice greffée C18. La colonne classique a 15cm de longueur, 4,6mm de diamètre interne, le diamètre des particules est de 5 ou 10mm. Un mélange de méthanol et d'eau est facile à utiliser, transparent aux U.V. et permet d'avoir des résultats satisfaisants. Au départ on travaille à température ambiante avec un débit de 1 à 2 ml/min, compatible avec la pression en tête de colonne.

Une large plage de composition de phase mobile (à base « méthanol - eau ») peut convenir. Mais pour atteindre une séparation convenable le plus vite possible, il vaut mieux débuter avec une force éluante importante et au besoin la diminuer. 100% de méthanol élue les composés très rapidement, mais peut être trop. 90% est un bon compromis de départ.

Avec 90% de méthanol, la force éluante est souvent encore trop importante ; tous les composés sortent proche du front de solvant (temps mort) et tous ne sont pas séparés.

Une bonne méthode consiste à diminuer la teneur en solvant organique (dans notre cas le méthanol) par pas de 10 ou 20% (90% 70% 50%...) et au besoin remonter par pas plus faibles de 5 ou 10% (55% ou 60% par exemple). De cette façon, on balaye rapidement la plage de force éluante de la phase mobile. La plupart du temps en 3 ou 4 injections un début de séparation apparaît.

2. Ajuster la sélectivité

Le solvant organique de la phase mobile

Les solvants organiques les plus usités sont l'acétonitrile, le méthanol et le tétrahydrofuranne (THF). Le THF est le moins utilisé car il a tendance à former des peroxydes explosifs quand il n'est pas stabilisé et est plus difficile à dégazer. Le mélange « méthanol - eau » mal dégazé a fortement tendance à former des bulles dans les têtes de pompe (à mélange basse pression) qui entraînent des fluctuations de débit, surtout en gradient de concentration. L'acétonitrile est cher.

Pour jouer sur la sélectivité, on remplace le méthanol par l'acétonitrile ou le THF. Le principe de l'optimisation avec les autres solvants est le même que dans le méthanol (70% 50% 30%... et au besoin remonter à 35% ou 40%).

En examinant plus précisément les chromatogrammes, on constate souvent que les 2 pics limitant la résolution ne sont pas toujours les mêmes lorsque l'on change la composition de la phase mobile. Il faut se souvenir tout de même qu'en chromatographie en général comme en HPLC, les pics ne sautent pas d'un bout à l'autre du chromatogramme, mais suivent une évolution régulière si l'on change la composition de la phase mobile.

En moyenne, la sélectivité avec l'acétonitrile est légèrement meilleure qu'avec le méthanol, mais chacun a ses habitudes de mise au point. L'acétonitrile utilisé en HPLC transparent aux U.V. de longueurs d'ondes courtes est plus cher que le méthanol. Dans la mesure du possible il vaut mieux financièrement utiliser le méthanol, surtout dans la phase de mise au point de l'analyse. Lors de l'optimisation l'expérience montre que l'on a souvent intérêt à utiliser l'acétonitrile.

Mélanges ternaires

A ce stade, il est parfois possible ou incontournable d'utiliser un mélange ternaire, mais la mise au point est plus complexe.

Par exemple si les résultats tout juste satisfaisants ont été obtenus en isocratique, avec 35% de CH3 CN (65% d'eau), ou avec 55% de CH3 OH (45% d'eau), il est possible qu'en faisant un mélange « 50/50 » des mélanges précédents, on obtienne une bonne séparation.

Pour cela, on peut réaliser un mélange ternaire de composition suivante :

17,5% de CH3 CN
27,5% de CH3 OH
et 55% d'eau

Le temps d'analyse devrait être la moyenne des 2 temps obtenus dans chacune des conditions isolées. De toute façon, un mélange binaire est plus simple à mettre en oeuvre qu'un mélange ternaire. En chromatographie aussi, le mieux étant l'ennemi du bien, si la séparation dans un mélange binaire est acceptable, il vaut mieux l'utiliser.

Gradient d'élution

Certains proposent des procédures de mise au point de méthodes qui préconisent d'utiliser un gradient de concentration pour balayer en une injection la plage de force éluante possible d'obtenir avec une phase mobile (par ex. de type « méthanol - eau »).

Dans ce cas, la force éluante est faible au début de chromatogramme, puis elle augmente progressivement . En polarité de phase inversée, la phase mobile contient peu de méthanol au moment de l'injection ; puis progressivement sa teneur augmente.

Suivant l'allure du chromatogramme obtenu, la pente du gradient peut être augmentée ou diminuée pour que le chromatogramme final présente tous les solutés bien séparés. Il est possible de modifier le profil du gradient à volonté suivant l'appareillage utilisé, d'y ajouter des paliers durant lesquels la composition de la phase mobile reste constante quelques instants.

3. Optimisation finale

Pour améliorer la séparation, il est possible de jouer sur différents paramètres comme la taille des particules de remplissage de la colonne. En diminuant leur diamètre ou en utilisant des particules plus régulières, on augmente généralement l'efficacité de la colonne.

L'optimisation consiste à trouver des conditions opératoires pour lesquelles la séparation

sera satisfaisante pour un temps d'analyse court :

Pour cela, la phase mobile doit avoir une force éluante importante (contenir beaucoup de méthanol) tout en gardant une sélectivité correcte.

La colonne doit être la plus courte possible. Le débit doit être important. Il est limité par la perte de charge provenant principalement de la colonne. Plus le diamètre des particules est faible, meilleure est l'efficacité mais plus importante est la pression.

La température a aussi son rôle, en particulier sur la finesse des pics et dans une moindre mesure sur le temps d'analyse. Le plus important est que, en maintenant la température, on s'assure de la répétabilité des chromatogrammes car on limite les variations locales de température dues aux frictions de la phase mobile sur la phase stationnaire.