Séries ST2S, STL biotechnologies

Méthodes ELISA et Test HIV

F Colomb — 2012-05-17T18:36:30Z

Cet article vous présente une méthode immunoenzymatique utilisée pour le dépistage des personnes séropositives au HIV (virus du SIDA). A la fin de cet article un protocole de dépistage vous est proposé.

La méthode ELISA
VIH et technique de dépistage

Protocoles expérimentaux

Partie 1 : La méthode ELISA

La méthode immuno-enzymatique ELISA (de l'anglais Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) qui correspond donc à un dosage immuno-enzymatique sur support solide, est un examen courant de laboratoire.

Cette méthode est principalement utilisée en immunologie pour détecter la présence d'un anticorps ou d'un antigène dans un échantillon.

L'ELISA est une technique biochimique utilisant un ou deux anticorps. L'un de ceux-ci est spécifique de l'antigène, tandis que l'autre réagit avec les complexes antigène-anticorps et est couplé à une enzyme. Cet anticorps secondaire, responsable du nom de la technique, permet, en présence d'un substrat chromogène, l'émission d'un signal par la production d'un produit coloré détectable voir quantifiable.

Voici deux animations expliquant le principe général d'une méthode ELISA

ELISA - Source : http://www.sumanasinc.com/

ELISA - Source :http://www.mheducation.com/home/index.shtml

L'ELISA pouvant être utilisé tant pour évaluer la présence d'un antigène que celle d'un anticorps dans un échantillon, c'est un outil efficace à la fois pour déterminer des concentrations sériques d'anticorps (comme pour le test HIV), que pour détecter la présence d'un antigène. Il a également trouvé des applications dans l'industrie alimentaire, pour détecter des allergènes alimentaires.

Ce test entre dans le cadre plus général des EIA (enzyme immunoassays), dans lequel le dosage est couplé à une réaction catalysée par une enzyme qui libère un composant coloré suivi par une spectroscopie, par opposition aux RIA (radio immunoassays) dans lesquels l'anticorps est marqué par un radioélément et dont le dosage mesure un nombre de désintégrations par secondes.

Ci dessous un document présentant la diversité des méthodes utilisables.

Diversité des méthodes ELISA

Partie 2 : VIH et technique de dépistage

Le virus de l'immunodéficience humaine (VIH) est un rétrovirus infectant l'homme et responsable du syndrome d'immunodéficience acquise (SIDA), qui est un état affaibli du système immunitaire le rendant vulnérable à de multiples infections opportunistes.

Transmis par plusieurs fluides corporels : sang, sécrétions vaginales, sperme ou lait maternel, le sida est aujourd'hui considéré comme une pandémie ayant causé la mort de plus de 25 millions de personnes entre 1981 et aujourd'hui.

Bien qu'il existe des traitements antirétroviraux luttant contre le VIH et retardant par conséquent l'apparition du SIDA, réduisant ainsi la mortalité, il n'existe à l'heure actuelle aucun vaccin ou traitement définitif. La prévention, qui passe notamment par les rapports sexuels protégés et la connaissance de son statut sérologique de manière à éviter les infections d'autrui, est le moyen de lutte le plus efficace.

Structure du virus

Le virus du VIH apparaît en microscopie électronique comme une particule sphérique de 80 à 120 nanomètres de diamètre.

L'enveloppe externe

Elle est composée de lipides issus des cellules humaines et de protéines virales qui traversent cette membrane lipidique :
— La protéine gp120 qui se fixe spécifiquement sur les protéines CD4 des lymphocytes et des macrophages.
— La protéine gp 41 participe à la fusion entre l'enveloppe virale et la membrane phospholipidique de la cellule.

La capside

Elle est faite de protéines virales. Libérées après destruction du virus, elles entraînent la formation d'anticorps.
La protéine p24 est la protéine majeure de la capside. La p17 est la protéine de la matrice qui réalise la connexion entre la capside et l'enveloppe externe.

Le génome

Le virus VIH possède 2 brins d'ARN identiques, comportant environ 9200 paires de bases, associés à des molécules de transcriptase inverse et à d'autres protéines enzymatiques

Le cycle de réplication du virus

L'enveloppe du virus se fixe à la surface d'une cellule sur une protéine de la membrane cellulaire CD4 (présente sur les lymphocytes T4 et les macrophages en particulier) qui lui sert de porte d'entrée. Une fois dans la cellule, le virus perd son enveloppe, libérant ainsi son noyau. Une enzyme virale, la transcriptase inverse permet à l'ARN du virus de se transformer en ADN et ainsi d'intégrer le noyau de la cellule, lui aussi formé d'ADN. Le noyau de la cellule considère désormais le matériel génétique du virus comme le sien et son activité biologique va être détournée au profit du virus. La cellule va donc se mettre à synthétiser en priorité de nouveaux ARN viraux et des protéines virales qui permettront la formation de nouveaux virus.

La technique ELISA permet la détection d'anticorps anti-VIH dans le sérum sanguin (d'où le terme de séropositivité ou de séronégativité). La technique présente une grande sensibilité (c'est-à-dire que la plupart des cas sont détectés, et que les « faux négatifs » - les tests négatifs alors que le patient est en réalité séropositif - sont très rares, du moins si le test est réalisé dans un délai de trois mois après le contact infectant) et une spécificité acceptable (c'est-à-dire un taux assez faible de « faux positifs »). Toutefois, en cas de sérologie anti-VIH positive, les échantillons seront soumis à des tests de confirmation, comme le western blot, dont le taux d'erreur est quasi-nul.

Partie 3 : Protocoles expérimentaux

Ces protocoles ont été mis en oeuvre dans le cadre du projet européen Comenius « The game of protein ».

Protocoles en français

Documents de présentation en français

Protocoles en anglais

Documents de présentation en anglais

Ces protocoles utilisent le kit ELISA de la société Biorad ref 166-2400

Réactifs individuels nécessaires :

Antigène	IgG de poulet	ref 1662406
Anticorps primaire	Anticorps de lapin anti IgG de poulet	ref 1662407
Anticorps secondaire	Anticorps de mouton anti-anticorps de lapin conjugué à l'HRP	ref 1662408
Substrat de l'HRP		ref 1662402
Tampon PBS
Tampon de lavage	Tampon PBS Tween

Bioinformatique et GFP (1/2)

F Colomb — 2011-03-27T18:22:35Z

Ce TD fait parti du dossier sur la protéine fluorescente verte GFP (Green Fluorescent Protein) dont vous retrouverez le sommaire à cette adresse.

Cette première partie va permettre de découvrir la structure de la protéine. Une deuxième partie sera consacrée à la séquence d'ADN codant pour cette protéine.

Structure de la GFP

1. Trouver une stucture protéique dans une banque de données de protéines

Connectez vous au site de la banque de données de protéines de Research Collaboratory for Structural Bioinformatics (RCSB)

http://www.pdb.org

Tapez le terme « green fluorescent protein » dans la barre de recherche située en haut de page et validez.

Choisir « Generate reports » puis « Image collage ».

Que remarquez vous ? Existe t'il qu'une seule molécule de GFP ?

Vous pouvez alors explorer différentes structures en cliquant sur les vignettes.

2. Exploration du squelette de la protéine

Pour la suite de l'exercice nous allons utiliser la GFP extraite de la meduse Aequorea victoria 1EMA.
La recherche se fait de la même façon en tapant le terme « 1EMA » dans la barre de recherche puis en validant.

Dans la partie droite de la page, vous observez l'image de la protéine avec dessous un certain nombre d'outils de visualisation. Certains fonctionnent avec la présentation « biological Assembly », d'autres avec « Asymetric Unit ».

Choisir « Asymetric Unit » puis « Other Viewers » et « QuickPDB ».
La fenêtre suibvante apparaît.

Vous retrouvez la séquence d'acides aminés dans le haute de la fenêtre et la structure spatiale de la protéine dans le bas.
Vous pouvez sélectionner des résidus d'acides aminés pour voir leur positionnement dans la molécule, manipuler la structure 3D avec la souris.
Toute mauvaise manipulation peut être annulée en cliquant sur le bouton « Reset ».

Combien de résidus d'acides aminés composent cette protéine ?

Quel sont les acides aminés en position 50, 100, 150 et 200 ?

Sélectionner le résidu 64 et glisser la souris sur le résidu suivant pour sélectionner les deux.

Quels sont ces deux résidus ? Quel est le n° du résidu après le n°64 ? Dans la structure de la protéine, sont ils liés ? Ou se situent-ils ?

3. Exploration de la structure secondaire de la protéine

Retourner à la page de départ en cliquant sur l'onglet « Summary ».
Sous l'image de la molécule, cliquez sur « Protein WorkShop ».
Acceptez l'ouverture du fichier proposé.

A gauche se situe la fenêtre de visualisation et à droite les commandes.
Vous pouvez, en vous aidant de la souris faire subir des rotations et des translations à la molécule et zoomer sur celle-ci.

Aller sur l'onglet « ShortCuts » et essayer de colorer les hélices alpha en bleu, les feuillets béta en rouge, les coudes béta en vert et les parties non structurées en gris. Changez la couleur de l'arrière plan en blanc.

En allant sur l'onglet « Options », enregistrer l'image de votre GFP.

Observez et déterminez le nombre de structures secondaires :
hélice alpha
feuillets beta
coude béta

4. Emplacement du groupement chromophore

Sur l'onglet « Tools » :
choisissez « Colors » -> ""Ribbons" -> « Active color en blanc » -> puis dans la boite 4 cliquez sur « ChainA ». Votre protéine doir apparaître en blanc.
choisissez « Visibility » -> « Atoms and Bonds » -> puis dans la boite 4 développer la séquence de la chaine A en cliquant sur le triangle situé à gauche du nom. Cliquez ensuite sur le résidu A66CRO. Le chromophore apparait sur la figure.

En allant sur l'onglet « Options », enregistrer l'image de votre GFP.

Ou se situe le chromophore au niveau de la structure spatiale de la protéine ?

5. Visualisation des liaisons H

Pour les observer, fermez la fenêtre de "Protein workshop et retournez au sommaire de la Protéine Data Bank sur la fiche de la GFP. Sous l'image cliquez sur « View in Jmol ».

Dans la boite de dialogue sous l'image choisissez :
style « Cartoon » ou « Backbone »
color « by chain »
surface « none »
puis sélectionnez la case « H-Bonds »

Les liaisons hydrogène apparaissent.

Ou se situent la grande majorité d'entre elles ? Essayez d'en déduire leur rôle.

Référence :

Fondé sur « Bioinformatics of Green Fluorescent Protein » du RSCB : Research Collaboratory for Structural Bioinformatics

Fichier complet à télécharger à cette adresse :
http://www.rcsb.org/pdb/education_discussion/educational_resources/gfp-bioinformatics-tutorial-summer2010.pdf

Production de GFP par E Coli

F Colomb — 2011-03-27T18:01:01Z

Le but de la manipulation est de transformer une souche d'E Coli K12 avec un plasmide (pGLO) contenant deux gènes d'intérêts, l'un pour la sélection et l'autre pour la mise en évidence de la transformation par synthèse de GFP :
un gène de résistance à l'ampicilline ;
un gène codant pour la GFP.

La GFP synthétisé sera ensuite extraite par chromatographie (TP2) puis caractérisé par électrophorèse (TP3)

Eléments de Principe

Principe de la production de GFP par E Coli

Protocole de TP

Transformation d'Ecoli K12 par le plasmide pGLO

Exemples de questionnement

Autour du principe :

Définir un plasmide
Définir la transformation
Justifier la composition du milieu de transformation
A quoi sert le choc thermique
Quels sont les caractères acquis par les bactéries transformées ?
Citer les deux autres types de transferts de matériels génétiques

Autour de la manipulation

Questionnement préalable

Quels résultats attendez vous ?

Plasmide	+pGLO	+pGLO	-pGLO	-pGLO
Milieu de culture	LB/amp	LB/amp/ara	LB/amp	LB
Résultats attendus

Sur quel(s) milieu(x) allez vous trouver des colonies de E Coli semblables à celles initialement utilisées pour la transformation ?
Sur quelle(s) boite(s) de Pétri allez vous trouver des cellules bactériennes transformées ?
Quels milieux pourront être comparés pour déterminer si une transformation bactérienne a bien eu lieu ?
Quelles différences observez vous entre les résultats des boites +pGLO/LB/amp et +pGLO/LB/amp/ara ?
Quelles sont les boites de Pétri qui servent de contrôle dans ce test ? Que contrôlent-elles ?

Analyses des résultats obtenus

Dresser un tableau de résultats en indiquant le nombre, la couleur, la fluorescence des colonies.
Décrire l'observation de la solution plasmidique pGLO
Quel est le nombre total de cellules fluorescentes déposées sur le milieu +pGLO/LB/amp/ara ?
Sachant que sur ce milieu l'équivallent de 0,16µg d'ADN plasmidique ont été déposé, calculer l'efficacité de la transformation (Nbre de transformation/µg d'ADN)

Principe de la production de GFP par E Coli

F Colomb — 2011-03-27T17:01:00Z

Télécharger le diaporama au format Power Point :

Détermination de la masse moléculaire de la GFP

F Colomb — 2011-01-26T15:30:27Z

Dans le cadre du projet européen Comenius « The Game of Protein » qui vous est présenté à cette adresse, une des manipulations réalisées est l'estimation de la masse moléculaire de la GFP.

Vous trouverez :
un article d'introduction sur la GFP
un diaporama de présentation de la GFP
un diaporama de présentation du principe de l'électrophorèse SDS-PAGE
un article présentant au travers d'images et de vidéos la manipulation permettant l'estimation de la masse moléculaire de la GFP par SDS-PAGE

et pour les étudiants le protocole de réalisation de la manipulation.

Estimation de la masse moléculaire de la GFP - Protocole

Détermination de la masse moléculaire de la GFP

F Colomb — 2011-01-26T15:13:50Z

Cet article fait partie du dossier « Détermination de la masse molaire de la GFP », mise en oeuvre dans le projet européen Comenius « The game of protein ».

Voici en quelques diapos et vidéos une présentation de la manipulation de détermination la masse moléculaire de la GFP

Récupération de la plaque de gel Préparation de la plaque de gel Préparation de la cuve d'électrophorèse Remplissage de la cuve d'électrophorèse Remplissage des puits du gel Mise en route de l'électrophorèse Démoulage du gel

Projet Européen - Recherche en protéomique

F Colomb — 2010-09-19T09:49:01Z

Le Lycée Léopold Sédar Senghor d'Evreux sera pour les années 2010 à 2012 l'un des partenaires d'un projet européen Comenius sur la recherche en protéomique.

Description du projet

Après décryptage du génome humain en avril 2003, une nouvelle ère a commencé dans la biologie, la recherche sur les produits des gènes : des protéines. La recherche dans ce secteur novateur de la biologie moléculaire est appelée la protéomique.

La protéomique désigne la science qui étudie les protéomes, c'est-à-dire l'ensemble des protéines d'une cellule, organites, tissu, organe ou organisme à un moment donné et sous des conditions données.
Dans la pratique, la protéomique s'attache à identifier les protéines extraites d'une culture cellulaire, d'un tissu ou d'un liquide biologique, leur localisation dans les compartiments cellulaires, leurs modifications post-traductionnelles ainsi que leur quantité.

Elle permet de quantifier les variations de leur taux d'expression en fonction du temps, de leur environnement, de leur état de développement, de leur état physiologique et pathologique, de l'espèce d'origine.

Elle étudie aussi les interactions que les protéines ont avec d'autres protéines, avec l'ADN ou l'ARN, ou d'autres substances. La protéomique fonctionnelle étudie les fonctions de chaque protéine.

Objectifs du projet :

Hormis les objectifs généraux d'augmentation des compétences en anglais des élèves et d'une meilleure connaissance de la culture et des traditions des autres pays européens, ce projet a pour objectifs spécifiques de :

développer avec l'ensemble des partenaires des modules pédagogiques (théoriques et pratiques) sur des thèmes concernant l'étude des protéines.
Ces modules seront présentés sur des supports multimédia regroupant protocoles expérimentaux, vidéos de présentation des manipulations, informations théoriques…
L'objectif final étant que ces modules puissent être utilisés pour la formation des élèves et des enseignants du domaine des biotechnologies dans l'ensemble de l'union européenne.

développer des centres de compétences pédagogiques sur la recherche protéomique dans chaque lycée partenaire du projet qui devront communiquer sur leur travaux auprès des établissement d'enseignement de leur pays.

stimuler l'intérêt d'un grand nombre de lycéen pour ce domaine de recherche.

Partenaires du projet :

Niels Stensen Gymnasium – Hambourg – Allemagne
Johanna Wittum Schule – Dforzeim – Allemagne
Kollegium Kalksburg – Vienne – Autriche
Biskupské Gymnazium – Brno – République Tchèque
Gymnazium vs Frantika Assiského – Levoca – Slovaquie
Fenyl Gyula Kollégium - Miskolc – Hongrie
IES Aynadamar – Grenade – Espagne
Vilniaus Jezulitu Gimnazja – Vilnius – Lituanie
Agenskalna Gimnazja – Riga – Lettonie
II Gimnazija Osijek – Osijek – Croatie
Lycée Senghor – Evreux – France

Déroulement du projet du 01 aout 2010 au 31 juillet 2012

Chaque partenaire prépare dans son établissement une présentation multimédia sur les trois modules cités ci-dessous.
Lors de rencontres de tous les partenaires, ces travaux sont évalués, mutualisés et optimisés pour aboutir à un module pédagogique unique.

Module n°1

Les enzymes : des protéines particulières.
Principes de détermination de la masse moléculaire d'une protéine.

Rencontre préparatoire des équipes enseignantes en octobre 2010 (Brno – République tchèque)
Regroupement des élèves et des enseignants en janvier 2011 (Pforzheim – Allemagne) : réalisation d'expériences et conférences théoriques (propriétés des enzymes et détermination de la masse moléculaire d'une protéine par électrophorèse).
Rencontre des équipes enseignantes en mai 2011 (Vienne – Autriche) pour
o l'évaluation et la mutualisation des travaux de chaque partenaire et l'optimisation du module.
o la préparation du module n°2

Module n°2

Expression des gènes in-vitro
Empreinte protéique – Identification de protéine (protein fingerprint)

Regroupement des élèves et des enseignants en septembre 2011 (Hambourg – Allemagne) : réalisation d'expériences et conférences théoriques (expression des gènes in-vitro et identification des protéines par électrophorèse 2D)
Rencontre des équipes enseignantes en février 2012 (Evreux - France) pour
o l'évaluation et la mutualisation des travaux de chaque partenaire et l'optimisation du module.
o la préparation du module n°3.

Module n°3

Purification des protéines par chromatographie sur colonne et méthode de détermination semiquantitative d'une protéine par immunoprécipitation

Regroupement des élèves et des enseignants en avril 2012 (Grenade – Espagne) : réalisation d'expériences et conférences théoriques (Purification des protéines par chromatographie sur colonne et méthode de détermination semiquantitative d'une protéine par immunoprécipitation)
Rencontre des équipes enseignantes en juillet 2012 (Levoca – Slovaquie) pour
o l'évaluation et la mutualisation des travaux de chaque partenaire et l'optimisation du module.
o La production du rapport final du projet.

Classes et enseignants concernés par le projet au lycée Senghor

1ère et Terminale STL-BGB (Sciences et Technologies de Laboratoire option Biochimie Génie Biologique)
Encadrés par des enseignants de l'équipe de Biochimie Génie Biologique