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Détection d'OGM dans un aliment

Catherine Chauvin, F Colomb — 2012-05-20T10:14:05Z

Cet article vous présente une méthode de détection d'OGM dans un aliment par PCR et électrophorèse d'ADN.

Les organismes génétiquement modifiés
Détection d'OGM dans un aliment et technique PCR

Protocoles expérimentaux

Partie 1 : Les organismes génétiquement modifiés

Vous pouvez retrouver à cette adresse une série d'affiche sur le thème des OGM réalisées par les étudiants de 2ème année du BTS Bioanalyses et Contrôles du lycée Léopold Sédar Senghor d'Evreux dans le cadre de la fête de la science 2010 dont le thème principal concernait la biodiversité.

Définition

Un organisme génétiquement modifié (OGM) est un organisme (animal, végétal, bactérie) dont on a modifié le matériel génétique par une technique dite de génie génétique pour lui conférer une caractéristique nouvelle.

Les techniques modernes de génie génétique, consistent à introduire un ou plusieurs gènes dans le patrimoine génétique d'un organisme et de construire des organismes dits "génétiquement modifiés". Ces techniques permettent de transférer des gènes sélectionnés d'un organisme à un autre, y compris entre des espèces différentes. Elles offrent ainsi la possibilité d'introduire dans un organisme un caractère nouveau.

Les applications du génie génétique concernent différents domaines :

Dans le domaine médical de nombreuses applications liée à la transgénèse sont rencontrées :

Les productions pharmacologiques : des dizaines de molécules sont fabriquées par des cellules transgéniques, y compris d'origine végétale : de nombreuses hormones (insuline, hormone de croissance), des anticorps ou encore des vaccins (vaccin contre le cancer du col del'utérus par exemple).

L'homme OGM ou la thérapie génique : méthode thérapeutique, pour l'heure expérimentale, qui repose sur une idée simple : si un gène est responsable d'une maladie, il suffit de remplacer le gène défectueux
par le gène intact pour guérir la maladie.

De nombreuses études sont en cours pour envisager le traitement de
cancers, de maladies neurodégénératives (Alzheimer…) ou encore
des maladies acquises comme par exemple la mucoviscidose

Dans le domaine agricole, des plantes génétiquement modifiées, telles que le maïs, le soja ou le coton possédant des propriétés de résistance à des insectes ravageurs des cultures, ou de tolérance à certains herbicides ainsi que des plantes résistantes à certaines maladies, sont commercialisées et cultivées dans certains pays.

Des plantes tolérantes à des conditions de stress environnemental telles que la sécheresse, la salinité, le froid, sont en cours de développement ou à l'étude.

Dans le domaine environnemental, des recherches sont conduites sur des plantes ou des micro-organismes permettant de dépolluer les sols contaminés et plus généralement d'éliminer les contaminants de l'environnement. Ces applications sont encore au stade de la recherche.

Par exemple des peupliers transgéniques sont utilisés pour réhabiliter d'anciennes friches industrielles : ils permettent de dépolluer des sols contaminés par des métaux toxiques, en les stockant dans leurs racines…

Dans l'industrie qui utilise de plus en plus fréquemment des OGM pour faciliter leurs processus de fabrication ou améliorer les rendements.

Par exemple dans l'industrie du papier, des arbres issus de plants
transgéniques sont utilisés. Tout en conservant leurs caractéristiques physiologiques, ces arbres donnent en industrie papetière de meilleurs rendements et un papier de meilleure qualité.

Des maïs, des betteraves sucrières ou de la canne à sucre génétiquement modifiés permettent d'obtenir de forts rendements en éthanol pour la production de biocarburant…

Dans le domaine de l'alimentation, de nouveaux aliments possédant des caractéristiques telle que l'enrichissement du riz en vitamine A ou en fer, permettant de lutter contre les maladies liés à des carences alimentaires, ou une modification en acides gras des huiles afin de limiter les risques de maladies cardiovasculaires, sont en cours de développement ou d'étude.

Comment les obtient-on ?

La possibilité de fabriquer un OGM repose sur le fait que l'ADN est de même nature pour tous les organismes vivants.

De ce fait, il est possible de transférer un gène d'un organisme donneur à un organisme receveur totalement différent. L'organisme receveur exprimera alors un caractère porté par le gène transféré issu de l'organisme donneur.

La figure ci-dessous présente les techniques de création d'une plante génétique. D'autres techniques peuvent être utilisées dans le cas des animaux et des micro-organismes.

Source : http://www.ogm.org

Source : http://www.ogm.org

Les gènes contiennent des signaux qui régulent leur expression. Ces signaux ne sont souvent pas compris par les cellules d'un autre organisme. Ainsi lors de l'étape d'intégration il faut modifier le gène de manière à ce que les cellules de la plante le lisent correctement et fabriquent la protéine d'intérêt. Il s'agit en particulier de modifier deux sites du gène :
le promoteur qui sert de site de fixation de l'ARN polymérase et de signal pour démarrer la transcription d'un gène ;
le terminateur, signal qui stoppe la transcription.

Le promoteur le plus couramment utilisé dans les cultures OGM est le promoteur 35S du vrus de la mosaïque du chou-fleur (CaMV 35S) qui par nature active la transcription dans tous les types de cellules végétales. Le terminateur est quant à lui celui de la nopaline synthase (NOS) provenant de Agrobactérium tumefaciens.

Partie 2 : Détection d'OGM dans un aliment et technique PCR

En Europe les aliments ne nécessitent un étiquetage particulier que s'ils contiennent une teneur en OGM > 1%.
Comment tester des aliments (ou des produits agricoles) pour savoir ceux qui contiennent des OGM ?

Deux méthodes sont actuellement utilisées :
la technique ELISA (Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay) qui identifie les protéines. Mais cette technique ne peut être utiliser que sur des produits frais, les protéines étant dégradées avec le temps et les traitements des aliments.
la seconde utilise la technique de PCR (Polymerase Chain Reaction) qui identifie les séquences d'ADN qui ont été insérées dans l'OGM.

De plus, alors qu'un test ELISA est spécifique d'une protéine donc d'un OGM, un seul test PCR peut mettre en évidence de nombreux OGM qui aurait intégrer le même promoteur et/ou terminateur dans leur construction.

Principe de la PCR

La « Polymerase Chain Reaction » ou PCR est une technique d'amplification génique in vitro. Elle permet d'obtenir, à partir d'un échantillon complexe et peu abondant, d'importantes quantités d'un fragment d'ADN spécifique et de longueur définie.

Le principe est de réaliser une succession de réactions de réplication d'une matrice double brin d'ADN. Chaque réaction met en oeuvre deux amorces oligonucléotidiques (ou « primers » en anglais) qui définissent alors, en la bornant, la séquence à amplifier (amplicon).

Quels sont les acteurs de la PCR :
l'ADN à amplifier,
des amorces, spécifiques du segment d'ADN voulu,
de la Taq polymérase (ADN polymérase thermostable)
du mélange des quatre désoxyribonucléotides constitutifs de l'ADN.

La PCR est ensuite une répétition cyclique de trois phases différentes à trois températures différentes : la dénaturation, l'hybridation et l'élongation.

Voici en deux animations le principe de la PCR expliqué :

Source : http://www.snv.jussieu.fr (Universite Pierre et Marie Curie - Paris)

Source : http://www.mheducation.com (Mac Graw Hill Education)

Réalisez une PCR grâce au laboratoire virtuel de PCR Cliquez sur l'image

Source : http://lifesciences.envmed. rochester.edu (Université de Rochester)

Partie 3 : Détection d'OGM dans un aliment : protocole

La technique employée utilisant une amorce pour le promoteur CaMV 35S et une pour le terminateur NOS, elle permet de détecter 85% des produits végétales modifiés génétiquement.

Protocole

Résultats et diagramme d'analyses des gels

Ce protocole utilisent le kit GMO Investigator de la société Biorad ref 166-2501

Méthodes ELISA et Test HIV

F Colomb — 2012-05-17T18:36:30Z

Cet article vous présente une méthode immunoenzymatique utilisée pour le dépistage des personnes séropositives au HIV (virus du SIDA). A la fin de cet article un protocole de dépistage vous est proposé.

La méthode ELISA
VIH et technique de dépistage

Protocoles expérimentaux

Partie 1 : La méthode ELISA

La méthode immuno-enzymatique ELISA (de l'anglais Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) qui correspond donc à un dosage immuno-enzymatique sur support solide, est un examen courant de laboratoire.

Cette méthode est principalement utilisée en immunologie pour détecter la présence d'un anticorps ou d'un antigène dans un échantillon.

L'ELISA est une technique biochimique utilisant un ou deux anticorps. L'un de ceux-ci est spécifique de l'antigène, tandis que l'autre réagit avec les complexes antigène-anticorps et est couplé à une enzyme. Cet anticorps secondaire, responsable du nom de la technique, permet, en présence d'un substrat chromogène, l'émission d'un signal par la production d'un produit coloré détectable voir quantifiable.

Voici deux animations expliquant le principe général d'une méthode ELISA

ELISA - Source : http://www.sumanasinc.com/

ELISA - Source :http://www.mheducation.com/home/index.shtml

L'ELISA pouvant être utilisé tant pour évaluer la présence d'un antigène que celle d'un anticorps dans un échantillon, c'est un outil efficace à la fois pour déterminer des concentrations sériques d'anticorps (comme pour le test HIV), que pour détecter la présence d'un antigène. Il a également trouvé des applications dans l'industrie alimentaire, pour détecter des allergènes alimentaires.

Ce test entre dans le cadre plus général des EIA (enzyme immunoassays), dans lequel le dosage est couplé à une réaction catalysée par une enzyme qui libère un composant coloré suivi par une spectroscopie, par opposition aux RIA (radio immunoassays) dans lesquels l'anticorps est marqué par un radioélément et dont le dosage mesure un nombre de désintégrations par secondes.

Ci dessous un document présentant la diversité des méthodes utilisables.

Diversité des méthodes ELISA

Partie 2 : VIH et technique de dépistage

Le virus de l'immunodéficience humaine (VIH) est un rétrovirus infectant l'homme et responsable du syndrome d'immunodéficience acquise (SIDA), qui est un état affaibli du système immunitaire le rendant vulnérable à de multiples infections opportunistes.

Transmis par plusieurs fluides corporels : sang, sécrétions vaginales, sperme ou lait maternel, le sida est aujourd'hui considéré comme une pandémie ayant causé la mort de plus de 25 millions de personnes entre 1981 et aujourd'hui.

Bien qu'il existe des traitements antirétroviraux luttant contre le VIH et retardant par conséquent l'apparition du SIDA, réduisant ainsi la mortalité, il n'existe à l'heure actuelle aucun vaccin ou traitement définitif. La prévention, qui passe notamment par les rapports sexuels protégés et la connaissance de son statut sérologique de manière à éviter les infections d'autrui, est le moyen de lutte le plus efficace.

Structure du virus

Le virus du VIH apparaît en microscopie électronique comme une particule sphérique de 80 à 120 nanomètres de diamètre.

L'enveloppe externe

Elle est composée de lipides issus des cellules humaines et de protéines virales qui traversent cette membrane lipidique :
— La protéine gp120 qui se fixe spécifiquement sur les protéines CD4 des lymphocytes et des macrophages.
— La protéine gp 41 participe à la fusion entre l'enveloppe virale et la membrane phospholipidique de la cellule.

La capside

Elle est faite de protéines virales. Libérées après destruction du virus, elles entraînent la formation d'anticorps.
La protéine p24 est la protéine majeure de la capside. La p17 est la protéine de la matrice qui réalise la connexion entre la capside et l'enveloppe externe.

Le génome

Le virus VIH possède 2 brins d'ARN identiques, comportant environ 9200 paires de bases, associés à des molécules de transcriptase inverse et à d'autres protéines enzymatiques

Le cycle de réplication du virus

L'enveloppe du virus se fixe à la surface d'une cellule sur une protéine de la membrane cellulaire CD4 (présente sur les lymphocytes T4 et les macrophages en particulier) qui lui sert de porte d'entrée. Une fois dans la cellule, le virus perd son enveloppe, libérant ainsi son noyau. Une enzyme virale, la transcriptase inverse permet à l'ARN du virus de se transformer en ADN et ainsi d'intégrer le noyau de la cellule, lui aussi formé d'ADN. Le noyau de la cellule considère désormais le matériel génétique du virus comme le sien et son activité biologique va être détournée au profit du virus. La cellule va donc se mettre à synthétiser en priorité de nouveaux ARN viraux et des protéines virales qui permettront la formation de nouveaux virus.

La technique ELISA permet la détection d'anticorps anti-VIH dans le sérum sanguin (d'où le terme de séropositivité ou de séronégativité). La technique présente une grande sensibilité (c'est-à-dire que la plupart des cas sont détectés, et que les « faux négatifs » - les tests négatifs alors que le patient est en réalité séropositif - sont très rares, du moins si le test est réalisé dans un délai de trois mois après le contact infectant) et une spécificité acceptable (c'est-à-dire un taux assez faible de « faux positifs »). Toutefois, en cas de sérologie anti-VIH positive, les échantillons seront soumis à des tests de confirmation, comme le western blot, dont le taux d'erreur est quasi-nul.

Partie 3 : Protocoles expérimentaux

Ces protocoles ont été mis en oeuvre dans le cadre du projet européen Comenius « The game of protein ».

Protocoles en français

Documents de présentation en français

Protocoles en anglais

Documents de présentation en anglais

Ces protocoles utilisent le kit ELISA de la société Biorad ref 166-2400

Réactifs individuels nécessaires :

Antigène	IgG de poulet	ref 1662406
Anticorps primaire	Anticorps de lapin anti IgG de poulet	ref 1662407
Anticorps secondaire	Anticorps de mouton anti-anticorps de lapin conjugué à l'HRP	ref 1662408
Substrat de l'HRP		ref 1662402
Tampon PBS
Tampon de lavage	Tampon PBS Tween

Bioinformatique et GFP (1/2)

F Colomb — 2011-03-27T18:22:35Z

Ce TD fait parti du dossier sur la protéine fluorescente verte GFP (Green Fluorescent Protein) dont vous retrouverez le sommaire à cette adresse.

Cette première partie va permettre de découvrir la structure de la protéine. Une deuxième partie sera consacrée à la séquence d'ADN codant pour cette protéine.

Structure de la GFP

1. Trouver une stucture protéique dans une banque de données de protéines

Connectez vous au site de la banque de données de protéines de Research Collaboratory for Structural Bioinformatics (RCSB)

http://www.pdb.org

Tapez le terme « green fluorescent protein » dans la barre de recherche située en haut de page et validez.

Choisir « Generate reports » puis « Image collage ».

Que remarquez vous ? Existe t'il qu'une seule molécule de GFP ?

Vous pouvez alors explorer différentes structures en cliquant sur les vignettes.

2. Exploration du squelette de la protéine

Pour la suite de l'exercice nous allons utiliser la GFP extraite de la meduse Aequorea victoria 1EMA.
La recherche se fait de la même façon en tapant le terme « 1EMA » dans la barre de recherche puis en validant.

Dans la partie droite de la page, vous observez l'image de la protéine avec dessous un certain nombre d'outils de visualisation. Certains fonctionnent avec la présentation « biological Assembly », d'autres avec « Asymetric Unit ».

Choisir « Asymetric Unit » puis « Other Viewers » et « QuickPDB ».
La fenêtre suibvante apparaît.

Vous retrouvez la séquence d'acides aminés dans le haute de la fenêtre et la structure spatiale de la protéine dans le bas.
Vous pouvez sélectionner des résidus d'acides aminés pour voir leur positionnement dans la molécule, manipuler la structure 3D avec la souris.
Toute mauvaise manipulation peut être annulée en cliquant sur le bouton « Reset ».

Combien de résidus d'acides aminés composent cette protéine ?

Quel sont les acides aminés en position 50, 100, 150 et 200 ?

Sélectionner le résidu 64 et glisser la souris sur le résidu suivant pour sélectionner les deux.

Quels sont ces deux résidus ? Quel est le n° du résidu après le n°64 ? Dans la structure de la protéine, sont ils liés ? Ou se situent-ils ?

3. Exploration de la structure secondaire de la protéine

Retourner à la page de départ en cliquant sur l'onglet « Summary ».
Sous l'image de la molécule, cliquez sur « Protein WorkShop ».
Acceptez l'ouverture du fichier proposé.

A gauche se situe la fenêtre de visualisation et à droite les commandes.
Vous pouvez, en vous aidant de la souris faire subir des rotations et des translations à la molécule et zoomer sur celle-ci.

Aller sur l'onglet « ShortCuts » et essayer de colorer les hélices alpha en bleu, les feuillets béta en rouge, les coudes béta en vert et les parties non structurées en gris. Changez la couleur de l'arrière plan en blanc.

En allant sur l'onglet « Options », enregistrer l'image de votre GFP.

Observez et déterminez le nombre de structures secondaires :
hélice alpha
feuillets beta
coude béta

4. Emplacement du groupement chromophore

Sur l'onglet « Tools » :
choisissez « Colors » -> ""Ribbons" -> « Active color en blanc » -> puis dans la boite 4 cliquez sur « ChainA ». Votre protéine doir apparaître en blanc.
choisissez « Visibility » -> « Atoms and Bonds » -> puis dans la boite 4 développer la séquence de la chaine A en cliquant sur le triangle situé à gauche du nom. Cliquez ensuite sur le résidu A66CRO. Le chromophore apparait sur la figure.

En allant sur l'onglet « Options », enregistrer l'image de votre GFP.

Ou se situe le chromophore au niveau de la structure spatiale de la protéine ?

5. Visualisation des liaisons H

Pour les observer, fermez la fenêtre de "Protein workshop et retournez au sommaire de la Protéine Data Bank sur la fiche de la GFP. Sous l'image cliquez sur « View in Jmol ».

Dans la boite de dialogue sous l'image choisissez :
style « Cartoon » ou « Backbone »
color « by chain »
surface « none »
puis sélectionnez la case « H-Bonds »

Les liaisons hydrogène apparaissent.

Ou se situent la grande majorité d'entre elles ? Essayez d'en déduire leur rôle.

Référence :

Fondé sur « Bioinformatics of Green Fluorescent Protein » du RSCB : Research Collaboratory for Structural Bioinformatics

Fichier complet à télécharger à cette adresse :
http://www.rcsb.org/pdb/education_discussion/educational_resources/gfp-bioinformatics-tutorial-summer2010.pdf

Production de GFP par E Coli

F Colomb — 2011-03-27T18:01:01Z

Le but de la manipulation est de transformer une souche d'E Coli K12 avec un plasmide (pGLO) contenant deux gènes d'intérêts, l'un pour la sélection et l'autre pour la mise en évidence de la transformation par synthèse de GFP :
un gène de résistance à l'ampicilline ;
un gène codant pour la GFP.

La GFP synthétisé sera ensuite extraite par chromatographie (TP2) puis caractérisé par électrophorèse (TP3)

Eléments de Principe

Principe de la production de GFP par E Coli

Protocole de TP

Transformation d'Ecoli K12 par le plasmide pGLO

Exemples de questionnement

Autour du principe :

Définir un plasmide
Définir la transformation
Justifier la composition du milieu de transformation
A quoi sert le choc thermique
Quels sont les caractères acquis par les bactéries transformées ?
Citer les deux autres types de transferts de matériels génétiques

Autour de la manipulation

Questionnement préalable

Quels résultats attendez vous ?

Plasmide	+pGLO	+pGLO	-pGLO	-pGLO
Milieu de culture	LB/amp	LB/amp/ara	LB/amp	LB
Résultats attendus

Sur quel(s) milieu(x) allez vous trouver des colonies de E Coli semblables à celles initialement utilisées pour la transformation ?
Sur quelle(s) boite(s) de Pétri allez vous trouver des cellules bactériennes transformées ?
Quels milieux pourront être comparés pour déterminer si une transformation bactérienne a bien eu lieu ?
Quelles différences observez vous entre les résultats des boites +pGLO/LB/amp et +pGLO/LB/amp/ara ?
Quelles sont les boites de Pétri qui servent de contrôle dans ce test ? Que contrôlent-elles ?

Analyses des résultats obtenus

Dresser un tableau de résultats en indiquant le nombre, la couleur, la fluorescence des colonies.
Décrire l'observation de la solution plasmidique pGLO
Quel est le nombre total de cellules fluorescentes déposées sur le milieu +pGLO/LB/amp/ara ?
Sachant que sur ce milieu l'équivallent de 0,16µg d'ADN plasmidique ont été déposé, calculer l'efficacité de la transformation (Nbre de transformation/µg d'ADN)

Principe de la production de GFP par E Coli

F Colomb — 2011-03-27T17:01:00Z

Télécharger le diaporama au format Power Point :

Les OGM

F Colomb — 2010-10-14T14:24:43Z

Dans le cadre de la fête de la science 2010 dont le thème principal concernait la biodiversité, les étudiants de 2ème année du BTS Bioanalyses et Contrôles du lycée Léopold Sédar Senghor d'Evreux ont réalisé une série d'affiche sur le thème des OGM.

Ces affiches ont été présentées dans le cadre du village des sciences d'Evreux.

Une première affiche présente ce qu'est la molécule d'ADN, sa localisation cellulaire et son principal rôle	Qu'est ce que l'ADN ?
Une seconde explique sur un exemple type, comment peut-on obtenir un OGM par les techniques les plus courantes	Techniques d'obtention des OGM
Une troisième donne un certain nombre d'exemples d'applications des OGM dans des domaines aussi variés que la santé, l'agriculture, l'environnement....	Applications des OGM
Une quatrième fait un inventaire rapide de l'utilisation des OGM dans le monde en présentant les principales cultures de plantes génétiquement modifiées et les principaux pays producteurs	Les OGM dans le monde
Une cinquième présente succinctement quelques techniques de détection des OGM utilisées en particulier par les organismes de contrôle	Techniques de détection des OGM
Enfin une dernière montre comment il est possible très simplement de produire un OGM dans un laboratoire d'enseignement...	Exemple de la production d'un OGM au lycée Senghor

Chacun de ces documents peut être téléchargé au format imprimable (pdf) au bas de cet article.

Extraction de l'ADN de kiwi

O Beaumesnil — 2010-01-19T16:32:53Z

Cette manipulation est un exemple de technique d'extraction de molécules intracellulaires. Elle permet d'extraire les molécules d'ADN contenues dans les cellules : il est possible alors d'observer la structure filamenteuse de cette molécule.
L'extraction de l'ADN est réalisée sur un végétal, le kiwi dont les cellules sont riches en ADN. La manipulation consiste à récupérer l'ADN contenu au cœur des cellules.
La technique d'extraction comporte plusieurs étapes : destruction mécanique (…)

- Biochimie et biologie moléculaire / Biologie cellulaire, Biologie moléculaire, ADN, Génomique, Laboratoire