Séries ST2S, STL biotechnologies

Utilisation d'une pipette automatique

O Beaumesnil — 2020-03-24T17:13:00Z

Il existe différentes pipettes automatiques : les plus courantes permettent de prélever des volumes de 10 µL à 1000 µL. C'est un matériel fragile demandant une utilisation rigoureuse : réglage du volume dans les seules limites de la pipette, utilisation de cônes adaptés, manipulation douce du piston, tenue verticale de la pipette. Les cônes sont fabriqués dans un matériau particulier et sont à usage unique : ils ne nécessitent pas d'essuyage de l'embout et ne demandent pas de mise en milieu...

Démonstration en vidéo

https://youtu.be/04EVx7wtkho

Diaporama commenté en vidéo sur le geste

[
https://youtu.be/04EVx7wtkho

Electrophorèse SDS PAGE : principe et exemple d'application en STL Biotechnologies

O Beaumesnil — 2012-06-12T18:28:13Z

L'objectif de cet article est de :
recenser quelques ressources (vidéos, animations, diaporamas...) permettant d'appréhender le principe de cette technique électrophorétique,
présenter des ressources en anglais permettant d'envisager une utilisation dans la cadre de la LV technologique de section STL Biotechnologies,
présenter un exemple d'application pratique en STL Biotechnologies, portant sur l'identification variétale de protéines de tissu musculaire de poisson.

Principe et mise en oeuvre de la SDS-PAGE

L'électrophorèse SDS-PAGE (électrophorèse en gel de polyacrylamide contenant du dodécysulfate de sodium) est une technique consistant à faire migrer des protéines dans un gel, sous l'influence d'un champ électrique, permettant ainsi leur séparation.

Voir le diaporama de présentation de la SDS-PAGE (en anglais) utilisé au lycée Senghor lors de l'échange Comenius sur la protéomique :

SDS-PAGE Principle

La manipulation nécessite :
une cuve à électrophorèse + un générateur électrique,
un gel de polyacrylamide (précoulé en cassette ou à préparer) contenant des puits pour dépôt,
des solutions tampons adaptées au gel.

Le gel de polyacrylamide est créé par la polymérisation d'acrylamide et de bis-acrylamide, en présence d'agents de polymérisation (TEMED, persulfate d'ammonium par exemple). Plus la concentration en acrylamide est élevée, plus les pores seront petits et plus les molécules seront freinées dans le gel.

Comme toute technique électrophorétique, la SDS-PAGE permet la séparation des particules se fait en fonction de leur charge électrique et pour des charges identiques, en fonction de leur taille.
Dans le cas de la SDS-PAGE, la séparation est réalisée en conditions dénaturantes en raison de l'ajout de SDS (dodécylsulfate de sodium) : le SDS est un détergent fort possédant une longue queue hydrocarbonée hydrophobe et une extrémité chargée négativement. Il intéragit avec les protéines par sa portion hydrocarbonée en liant leurs régions hydrophobes. En se liant à la protéine, le SDS empêche son repliement et lui confère une charge nette négative.
La structure native de la protéine est donc dénaturée, et une charge apparente négative est alors conférée à la protéine.

En présence de SDS, les protéines auront donc toutes une charge apparente négative, elles migreront donc toutes vers l'anode. Cela signifie que seul le poids moléculaire des protéines sera le facteur de leur séparation. Les protéines ayant un petit poids moléculaire, seront moins retenues dans les pores du gel de polyacrylamide et migreront donc plus loin que les grosses.

Remarque : on ajoute aussi très souvent au mélange dénaturant du 2-mercaptoéthanol. Ce composé réduit les pont disulfures unissant les différentes sous-unités des protéines oligomériques. Chaque sous-unité, une fois dissociée, fixe le SDS et prend une charge apparente négative. Les sous-unités étant dissociées, sur le gel, apparaitrons après migration, autant de bande qu'il y avait de sous-unités constitutives.

Exemple de simulation animée d'une électrophorèse SDS-PAGE :

Choisissez la masse moléculaire des protéines étalons A, B, C et D, puis cliquer sur « START » et immédiatement après sur « STRAIN » pour visualiser la progression des protéines dans le gel. A tout moment il est possible d'appuyer sur « STOP » pour arrêter la progression :

Source : www.winona.edu

Réalisation d'une électrophorèse SDS-PAGE

Les protéines, préalablement traitées en conditions dénaturantes, sont tout d'abord condensées dans un gel de concentration puis séparées dans un gel de séparation. Lorsque les protéines ont été séparées, leur révélation sur le gel peut être effectuée en les colorant directement (Bleu de Coomassie par exemple). Cette coloration permet de visualiser toutes les protéines dans l'échantillon dont la concentration dépasse la limite de détection de la coloration. Le gel coloré au bleu de Coomassie peut être ensuite transparisé par un mélange méthanol/acide acétique/eau.

Voir ci-dessous en vidéo (en anglais) les différentes étapes de progression des protéines au sein d'un gel :

Source : www.geened.com

Exemple de gel après coloration au bleu de Coomasie :

Exemple d'application pratique en STL Biotechnologies : identification variétale de poisson par caractérisation de protéines du tissu musculaire

Intérêt de la manipulation

Grâce à la SDS-PAGE, il est possible de déterminer assez finement la présence d'une protéine donnée dans un échantillon protéique. Une protéine sera caractérisée par une masse moléculaire donnée.
L'objectif de la séance est de caractériser, chez un poisson, une protéine du tissu musculaire, l'actine, qui est impliquée dans les mécanismes de contraction musculaire. Dans chaque variété de poissons, on retrouvera des forme d'actine ayant des caractéristiques précises, permettant ainsi de comparer des variétés entre-elles : on parle d'identification variétale. Il est ainsi possible de comparer entre-elles les protéines de différentes variétés d'une espèce en comparant leurs masses moléculaires.

Dans la séance proposée nous testerons deux échantillons :

un échantillon de référence, constitué par du tissu de saumon sauvage,
un échantillon de saumon à tester commercialisé comme étant d'origine sauvage.
Les saumons d'élevage, souvent croisés avec des truites, ayant des caractéristiques sensiblement différentes des saumons sauvages, nous allons vérifier, par comparaison de leur actine, que le saumon commercialisé comme étant d'origine sauvage, n'est pas un poisson d'élevage.

Protocole et matière d'oeuvre à télécharger :

Exemple de protocole

Exemples d'exploitation possibles :

Questions de compréhension :
Justifier le rôle des différents constituants du tampon Laemmli. Justifier le rôle du bleu de Coomassie, puis de l'étape de transparisation sous l'eau.

Proposer un schéma légendé et annoté du montage électrophorétique et expliquer le rôle des différents éléments.

Repérer sur le gel les bandes correspondant à l'actine.

Expliquer les différences de migration observées pour les différentes protéines du mélange étalon.

Tracer la courbe d'étalonnage (log masse moléculaire en kDa = f (distance de migration à l'aide de l'outil informatique.

A l'aide de la courbe d'étalonnage, déterminer la masse moléculaire de l'actine des deux variétés de poissons testés et conclure sur l'origine du saumon testé.

Des bonbons au laboratoire !

N Bergère — 2012-05-31T13:37:14Z

Des confiseries gélifiées en forme d'ourson très appréciées des enfants ont la composition suivante :
« Sirop de glucose, Sucre, Gélatine, Acidifiant : acide citrique, Dextrose, Jus de fruits concentrés, Arômes »

Trois objectifs de séquences au laboratoire sont définis :

application de la chromatographie d'exclusion moléculaire à la séparation des constituants du bonbon gélifié avec contrôle de l'efficacité de la séparation par le dosage des protéines et du glucose,
dosage de l'acidité du bonbon
contrôle de la composition en sucres et en protéines de ces confiseries annoncée sur l'emballage :

Protéines	6,2 g pour 100 g
Sucres	78 g pour 100 g

La gélatine est une protéine animale extraite, après hydrolyse, de matières premières riches en collagène.

Trois matières premières sont utilisées pour obtenir industriellement la gélatine :
Les couennes de porc toujours traitées par hydrolyse acide et conduisant donc à des gélatines de type A,
Les peaux de bovin toujours traitées par hydrolyse alcaline et conduisant donc à des gélatines de type B,
Les os qui peuvent être de type A ou B.

Que l'hydrolyse ait été réalisée en milieu acide ou en milieu alcalin, la gélatine est ensuite extraite à l'eau chaude à des températures croissantes.
Viennent alors des opérations de filtration, désionisation, concentration, stérilisation, gélification, extrusion, séchage, et broyage permettant d'obtenir le produit fini.

Procédés de fabrication de la gélatine alimentaire (source Adrianor)

Après dissolution dans l'eau chaude et refroidissement, la gélatine forme un gel qui présente de nombreux avantages pour des applications alimentaires :

il est très clair, et cette transparence est recherchée notamment dans les confiseries,
il est réversible, c'est à dire qu'il fond lorsqu'il chauffe au delà d'une température dite point de fusion qui se situe entre 27 et 35°C, ce qui est intéressant quand on recherche une fusion en bouche.

La formation du gel va dépendre :
de la gélatine elle-même (degré bloom),
de la durée et de la température : le gel se forme immédiatement à 10°C, mais il faut environ 16 heures pour atteindre la gélification maximale,
et de la concentration en gélatine : elle doit être de 0,8 % minimum pour qu'il y ait gélification, c'est ce qu'on appelle la concentration critique de gélification.

Exemples d'utilisation de la gélatine :

Un grand nombre de produits alimentaires contiennent de la gélatine. Elle est utilisée comme épaississant, stabilisant ou agent texturant dans des produits comme les confiseries, les crèmes glacées, les confitures, les yaourts, la margarine, les gateaux… Elle est également utilisée dans les produits allégés pour stimuler la sensation de gras en bouche et créer du volume sans ajouter de calories.
Dans l'industrie pharmaceutique, la gélatine est l'un des principaux constituants des gélules contenant des médicaments. Dans l'industrie cosmétique elle fait partie de la composition de certaine crème.

Séparation des constituants du bonbon gélifié par chromatographie d'exclusion moléculaire

La gélatine alimentaire utilisée pour la préparation de ces confiseries est le seul constituant macromoléculaire entrant dans la composition. Il est donc possible d'effectuer la purification de la gélatine de l'échantillon par chromatographie d'exclusion moléculaire (ou gel-filtration) sur gel de Séphadex® G-25.

Le domaine de fractionnement de ce gel est de 1000 à 5000 g/mol. La gélatine sera donc totalement exclue de ce gel alors que les autres molécules suffisamment petites (glucose, saccharose, acide citrique…) pourront pénétrer dans les mailles du réseau moléculaire du gel et parcourront un chemin plus long que les grosses molécules de gélatine qui ne pénètrent pas dans le gel : toutes ces petites molécules seront donc éluées plus tardivement.

Principe de la chromatographie d'exclusion

Ce type de chromatographie est encore appelé : tamisage moléculaire, gel-filtration ou perméation de gel.

Cette technique permet la séparation des molécules en fonction de leur taille et de leur forme. On utilise pour cela des granules de gel poreux.

Les grosses molécules (dont le diamètre est supérieur à celui des pores) sont exclues et sont donc éluées les premières, au niveau du volume mort ( Vm ou V0 ). Les petites et moyennes molécules sont éluées plus tardivement, car incluses dans le gel, leur migration est freinée.

Les solutés sont donc élués dans l'ordre inverse des masses moléculaires. Il existe une relation linéaire entre le volume d'élution et le logarithme de la masse moléculaire.

Voici deux animations expliquant le principe de la chromatographie d'exclusion :

source : http://www.geniebio.ac-aix-marseille.fr/bioch/docs/tamisage.html

source : http://www.austincc.edu/biocr/index.html

Séparation des constituants des bonbons

Fiche protocole n°1	Fiche protocole n°2	Fiche technique GE Healthcare
Préparation de l'échantillon pour les analyses	Séparation de la gélatine par exclusion moléculaire	Colonne HiTrap Desalting

Dosage de la gélatine et des sucres des bonbons et obtention du profil chromatographique

Fiche protocole n°3	Fiche protocole n°4	Fiche technique BioMérieux
Dosage de la gélatine par la méthode de Biuret	Dosage du glucose par méthode enzymatique en point final	Kit RTU Glucose

Analyses possibles autour des manipulations :

En utilisant l'outil informatique, tracer la courbe d'étalonnage A lue à 540 nm = f ( masse de gélatine dans tube ).
Valider les points expérimentaux et donner les paramètres de la droite de régression.
Calculer la concentration en gélatine de l'échantillon « B ».
En déduire la teneur des bonbons gélifiés en pourcentage en masse et comparer à la valeur annoncée.
Tracer le profil d'élution de la gélatine.
Calculer la masse de gélatine récupérée dans chaque fraction analysée.
En déduire le rendement de récupération de la gélatine au cours de la chromatographie.
Calculer la concentration en glucose de l'échantillon « B ».
Grâce au dosage de l'hydrolysat « H », calculer la concentration en saccharose de l'échantillon « B ».
En déduire la teneur en glucose et saccharose des bonbons gélifiés en pourcentage en masse et comparer à la valeur annoncée.*
Tracer le profil d'élution du glucose.
Calculer la masse de glucose récupérée dans chaque fraction analysée.
En déduire le rendement de récupération du glucose au cours de la chromatographie.
Analyser le profil d'élution ci-dessous :

Dosage volumétrique d'un polyacide : l'acide citrique

Fiche technique n°5

Bioinformatique et GFP (1/2)

F Colomb — 2011-03-27T18:22:35Z

Ce TD fait parti du dossier sur la protéine fluorescente verte GFP (Green Fluorescent Protein) dont vous retrouverez le sommaire à cette adresse.

Cette première partie va permettre de découvrir la structure de la protéine. Une deuxième partie sera consacrée à la séquence d'ADN codant pour cette protéine.

Structure de la GFP

1. Trouver une stucture protéique dans une banque de données de protéines

Connectez vous au site de la banque de données de protéines de Research Collaboratory for Structural Bioinformatics (RCSB)

http://www.pdb.org

Tapez le terme « green fluorescent protein » dans la barre de recherche située en haut de page et validez.

Choisir « Generate reports » puis « Image collage ».

Que remarquez vous ? Existe t'il qu'une seule molécule de GFP ?

Vous pouvez alors explorer différentes structures en cliquant sur les vignettes.

2. Exploration du squelette de la protéine

Pour la suite de l'exercice nous allons utiliser la GFP extraite de la meduse Aequorea victoria 1EMA.
La recherche se fait de la même façon en tapant le terme « 1EMA » dans la barre de recherche puis en validant.

Dans la partie droite de la page, vous observez l'image de la protéine avec dessous un certain nombre d'outils de visualisation. Certains fonctionnent avec la présentation « biological Assembly », d'autres avec « Asymetric Unit ».

Choisir « Asymetric Unit » puis « Other Viewers » et « QuickPDB ».
La fenêtre suibvante apparaît.

Vous retrouvez la séquence d'acides aminés dans le haute de la fenêtre et la structure spatiale de la protéine dans le bas.
Vous pouvez sélectionner des résidus d'acides aminés pour voir leur positionnement dans la molécule, manipuler la structure 3D avec la souris.
Toute mauvaise manipulation peut être annulée en cliquant sur le bouton « Reset ».

Combien de résidus d'acides aminés composent cette protéine ?

Quel sont les acides aminés en position 50, 100, 150 et 200 ?

Sélectionner le résidu 64 et glisser la souris sur le résidu suivant pour sélectionner les deux.

Quels sont ces deux résidus ? Quel est le n° du résidu après le n°64 ? Dans la structure de la protéine, sont ils liés ? Ou se situent-ils ?

3. Exploration de la structure secondaire de la protéine

Retourner à la page de départ en cliquant sur l'onglet « Summary ».
Sous l'image de la molécule, cliquez sur « Protein WorkShop ».
Acceptez l'ouverture du fichier proposé.

A gauche se situe la fenêtre de visualisation et à droite les commandes.
Vous pouvez, en vous aidant de la souris faire subir des rotations et des translations à la molécule et zoomer sur celle-ci.

Aller sur l'onglet « ShortCuts » et essayer de colorer les hélices alpha en bleu, les feuillets béta en rouge, les coudes béta en vert et les parties non structurées en gris. Changez la couleur de l'arrière plan en blanc.

En allant sur l'onglet « Options », enregistrer l'image de votre GFP.

Observez et déterminez le nombre de structures secondaires :
hélice alpha
feuillets beta
coude béta

4. Emplacement du groupement chromophore

Sur l'onglet « Tools » :
choisissez « Colors » -> ""Ribbons" -> « Active color en blanc » -> puis dans la boite 4 cliquez sur « ChainA ». Votre protéine doir apparaître en blanc.
choisissez « Visibility » -> « Atoms and Bonds » -> puis dans la boite 4 développer la séquence de la chaine A en cliquant sur le triangle situé à gauche du nom. Cliquez ensuite sur le résidu A66CRO. Le chromophore apparait sur la figure.

En allant sur l'onglet « Options », enregistrer l'image de votre GFP.

Ou se situe le chromophore au niveau de la structure spatiale de la protéine ?

5. Visualisation des liaisons H

Pour les observer, fermez la fenêtre de "Protein workshop et retournez au sommaire de la Protéine Data Bank sur la fiche de la GFP. Sous l'image cliquez sur « View in Jmol ».

Dans la boite de dialogue sous l'image choisissez :
style « Cartoon » ou « Backbone »
color « by chain »
surface « none »
puis sélectionnez la case « H-Bonds »

Les liaisons hydrogène apparaissent.

Ou se situent la grande majorité d'entre elles ? Essayez d'en déduire leur rôle.

Référence :

Fondé sur « Bioinformatics of Green Fluorescent Protein » du RSCB : Research Collaboratory for Structural Bioinformatics

Fichier complet à télécharger à cette adresse :
http://www.rcsb.org/pdb/education_discussion/educational_resources/gfp-bioinformatics-tutorial-summer2010.pdf

Procédé : Emulsion

F Colomb — 2010-01-27T18:39:18Z

On peut définir une émulsion en tant que dispersion ou suspension de gouttelettes liquides dans une phase liquide continue (Dickinson, 1992).

Une émulsion est une préparation généralement liquide (parfois de viscosité élevée) qui est une dispersion d'un liquide dans un autre liquide non miscible.

La préparation d'une émulsion permanente signifie la dispersion d'une phase liquide dans une autre phase liquide non miscible à la première sous forme de gouttelettes suffisamment fines pour qu'une déstabilisation n'apparaisse pas ou soit suffisamment lente lors de la conservation ou de traitement ultérieur.

Le diaporama joint présente :

les différents types d'émulsion
la stabilité et/ou l'instabilité des émulsions
les relations entre paramètres d'élaboration, structure et texture
les procédés d'émulsion
et les analyses et contrôles de ces émulsions

Les émulsions

Procédés utilisés en industrie cosmétique
et agro-alimentaire

Les glucides

N Bergère — 2010-01-24T16:11:04Z

Voici un cours sur les glucides destiné aux étudiants de BTS et plus particulièrement à ceux de BTS BioAnalyses et Contrôles.

INTRODUCTION

Aspect quantitatif
Aspect qualitatif
Classification

Sous chapitre 1 : STRUCTURE DES OSES

I . PRESENTATION GENERALE DES OSES

1° ) Définition
2° ) Classification

II . ISOMERIE DES OSES

1° ) Définition générale
2° ) Exemple du glycéraldéhyde
3° ) Pour les autres oses

III . NOMENCLATURE D ET L ET FILIATION DES OSES

1° ) Série D et série L
2° ) Filiation des aldoses
3° ) Filiation des cétoses
4°) Remarque : Ecriture simplifiée de Reichstein

IV . STRUCTURE CYCLIQUE DES OSES

1° ) Anomalies de la forme linéaire
2° ) Cyclisation des aldoses
3° ) Cyclisation des cétoses
4° ) Les principaux oses et leur état naturel
5° ) Conformation des formes cycliques

V . LES PRINCIPAUX OSES ET DERIVES D'OSES

1° ) Oses couramment rencontrés
2° ) Les dérivés d'oses

Voir la structure des oses - Cliquer sur la vignette

PROPRIETES DES OSES

I . PROPRIETES PHYSIQUES DES OSES

1° ) Pouvoir rotatoire
2° ) Indice de réfraction

II . PROPRIETES CHIMIQUES DES OSES
1° ) Pouvoir réducteur des oses
2° ) Autres propriétés de la fonction hémiacétalique
3° ) Propriétés dues aux fonctions alcool
4° ) Autres propriétés

Voir les propriétés des oses - Cliquer sur la vignette

LES OSIDES

I . LA LIAISON OSIDIQUE

1° ) Définition
2° ) Les différents types de liaisons osidiques entre 2 oses
3° ) Nomenclature et convention
4° ) Méthodes d'étude de la liaison osidique

II . LES PRINCIPAUX DIHOLOSIDES

1° ) Les diholosides réducteurs
2° ) Les diholosides non réducteurs
3° ) Les disaccharidases
4° ) Autres oligoholosides

III . LES POLYHOLOSIDES

1° ) L'amidon
2° ) Le glycogène
3° ) La cellulose
4° ) Les autres ployholosides

IV . LES HETEROSIDES

1° ) Les hétéro-oligosides
2° ) Les glycoconjugués

Voir les osides - Cliquer sur la vignette

PRINCIPALES METHODES D'ANALYSE DES GLUCIDES

I . EXTRACTIONS SELECTIVES

1° ) Oses et oligosides
2° ) Les polyosides

II . FRACTIONNEMENT ET IDENTIFICATION

1° ) Fractionnement
2° ) Identification

III . DOSAGE DES OSES ET OSIDES

1° ) Méthodes physiques
2° ) Méthodes chimiques
3° ) Méthodes enzymatiques

IV . DETERMINATION DE LA STRUCTURE DES OSIDES

Voir les principales méthodes d'études des glucides - Cliquer sur la vignette

EXERCICES D'APPLICATION

Ouvrir les exercices d'application - Cliquer sur la vignette

Schéma récapitulatif métabolisme

F Colomb — 2010-01-22T14:02:04Z

Ci dessous un fichier Excel, modifiable et imprimable, récapitulatif du métabolisme énergétique.

- Biochimie et biologie moléculaire / Biochimie, Enzymologie, Métabolisme

Diaporama d'enzymologie BTS BioAC

N Bergère — 2010-01-22T11:10:54Z

Le diaporama ci-joint est un document de synthèse des notions d'enzymologie abordées en première année de BTS BioAnalyses et Contrôles.
Mis à jour septembre 2010

- Biochimie et biologie moléculaire / Biochimie, Enzymologie, Métabolisme, BTS

Utilisation du matériel de laboratoire

N Bergère — 2010-01-22T09:09:32Z

Ci-dessous des protocoles d'utilisation de quelques matériels de laboratoires :

Utilisation des pipettes

Utilisation des pipettes

Utilisation des fioles jaugées

Utilisation des fioles jaugées

Utilisation de la burette

Utilisation de la burette

Utilisation des pipettes automatiques

Utilisation des pipettes automatiques

Utilisation de la balance

Utilisation de la balance

Détermination de KM et Vmax

F Colomb — 2010-01-21T15:23:35Z

Détermination de KM et Vmax

Exemple de la phosphatase alcaline